基本信息
- 项目名称：
- 三种食源性致病菌的PCR快速检测
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 本研究建立的对沙门氏菌、大肠杆菌、单增李斯特菌的单独PCR检测和多重RCR快速检测方法，可以三小时内在同一PCR管中同时快速、特异、灵敏的检测出这三种致病菌，为食品中致病菌的快速检测提供了新手段和理论依据。
- 详细介绍：
- 本项目针对目前国内外的食品卫生标准，以食品中常见的3种食源性致病菌——大肠杆菌、沙门氏菌、单增李斯特菌为研究对象，分别用各自的特异性引物进行单独PCR扩增和双重PCR、三重PCR扩增，验证引物的特异性，不断优化PCR反应体系，建立对沙门氏菌、大肠杆菌、单增李斯特菌的多重RCR 快速检验方法。该方法可以在3小时内在同一PCR管中同时快速、灵敏及特异检测大肠杆菌、沙门氏菌、单增李斯特菌，可推广应用于食品卫生监督、环境监测、水源检测、商品检验检疫等领域。
作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 目的: 建立对三种食源性致病菌--大肠杆菌、单增李斯特菌、沙门氏菌的快速、敏感、特异的单独PCR和多重PCR诊断检验方法，为食源性致病菌的多重PCR快速检测提供理论依据和实验指导。 基本思路: 先提取这三种食源性致病菌的DNA，分别用各自的特异性引物进行PCR扩增，验证引物的特异性，不断优化PCR反应体系,建立对沙门氏菌、大肠杆菌、单增李斯特菌的RCR 快速检验方法。
科学性、先进性及独特之处
- 微生物的检测是食品检验中的一项重要内容。目前常规方法操作繁琐，耗时长，通常需要几天的培养鉴定时间，不能达到快速监测食品的目的。本研究在多次重复实验的基础上，确立了PCR检测的优化体系和条件，建立的对三种食源性致病菌PCR快速检测，相对于传统检测方法，极大地缩短了检测时间，具有灵敏、简便、特异性强的优点。从而在一定程度上提前消除由于食品中的致病菌所造成的危害，提高食源性疾病的检测和控制能力。
应用价值和现实意义
- 大肠杆菌、单增李斯特菌和沙门氏菌是常见污染食品的致病菌，主要通过食品、饮水感染人类，严重侵害人类健康。目前，这三种食源性致病菌是我国进出口食品的主要检测项目，其常规方法需多个步骤，操作复杂，检测周期长。本研究建立能特异、灵敏、快速检测出食品中大肠杆菌、单增李斯特菌和沙门氏菌的PCR检测方法。这样既可避免污染，又具有简便、信息量大的特点，可推广应用于食品卫生监督、环境监测、水源检测等领域。
学术论文摘要
- 本研究目的是建立对三种食源性致病菌--沙门氏菌、大肠杆菌、单增李斯特菌的快速、敏感、特异的单独PCR和多重PCR诊断检验方法，为食源性致病菌的多重PCR快速检测提供理论依据和实验指导。方法是先提取大肠杆菌、沙门氏菌、单增李斯特菌这三种食源性致病菌的DNA，分别用各自的特异性引物进行三种菌的单独PCR，之后将三种菌两两组合进行双重PCR以及三种菌同时进行三重PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外透射仪下观察电泳结果。得到的实验结果与结论：三种食源性致病菌单独PCR扩增都得到目的片断，大肠杆菌约1000 bp，单增李斯特菌约750 bp,沙门氏菌约300 bp，没有扩增出其它非特异性片段。双重PCR和三重PCR检测结果与单基因PCR检测的灵敏度相同，也都获得了相应的片段。用三种菌分别人工感染两种常见食品——饮料与面包，PCR检测的结果均获得目的菌的特异性片段，并且结果稳定。本研究建立的对沙门氏菌、大肠杆菌、单增李斯特菌的单独PCR检验和多重RCR快速检验方法，可以同时快速、特异、灵敏的检测出这三种致病菌，为食品中致病菌的快速检测提供了新手段和理论依据。
获奖情况
- 2011年5月12日云南农业大学第九届“挑战杯”学生课外学术科技作品竞赛二等奖 2011年5月31日第六届云南高校青年学术科技节终审决赛三等奖
鉴定结果
- 2011年5月12日云南农业大学第九届“挑战杯”学生课外学术科技作品竞赛二等奖 2011年5月31日第六届云南高校青年学术科技节终审决赛三等奖
参考文献
- [1]ISBN 92 4554574 1 NLM classification. WHO global strategy for food safety. 2002. [2]李业鹏，钟凯.食品中沙门菌PCR检测方法的建立[J]. 中国食品卫生杂志，2006， 8(1):17-22. [3]鲁满新．现代检测技术在食品安全中的应用[J]．安徽农业科学，2007，35(21)： 6 589-6 590 [4]黄韬睿，李玉锋，王鑫．PCR和ELISA在食源性致病菌检测中的应用[J]．现代农业科技，2008，9：182-184 [5]Malorny B,Paccassoni E,Fach P,et al.Diagnostic realtime PCR for detection of Salmonella in food[J].Applied and Environmental Microbiology,2004,7046-7052. [6]Malorny B,Hoorfar J,Bunge C,et al.Multicenter validation of the analytical accuracy of Salmonella PCR:towards an international standard[J].Applied and Enviromental Microbiology,2003,69(1):290-296. [7]林蕾，张炜．食品微生物检测技术的研究进展[J]．现代农业科学，2008，15(10)：97-99
同类课题研究水平概述
- 由食源性病原微生物所引起的食物中毒事件，绝大多数是由病原性细菌所致，常见的有沙门氏菌、志贺氏菌、致泻性大肠埃希氏菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌等。其中大肠杆菌、沙门氏菌、单增李斯特菌是最常见污染食品的致病菌，主要通过食品、饮水感染人类,导致细菌性食物中毒，同时这三种食源性致病菌还是食品常规微生物检测中的指示菌。 目前，国标中提供的检测病原菌方法为传统的分离培养，包括生化和血清学鉴定等多个复杂的过程，一般需4～7天，操作繁琐，需时长、存在特异性不强、灵敏度不高等问题，而且环境中还存在一些难以培养和不可培养的微生物，因此这些方法已不能完全适应于卫生检测的需要。自从十九世纪八十年代中期, PCR技术的引入已证明是一种具有不可估量价值的方法,它能够快速,敏感,特异地从不同的食品样品中检出病原菌,具有广阔的应用前景。 分子生物学方法是食源性致病菌检测方法的主要发展方向。聚合酶链反应(PCR)是近十多年来应用最广的分子生物学方法，在食源性致病菌的检测中，一般是以其遗传物质高度保守的核酸序列设计特异性引物进行扩增，进而用凝胶电泳和紫外核酸检测仪观察扩增结果。分子生物学方法由于操作简单、反应快速、灵敏度高、特异性强，并可以对难以培养的微生物进行检测，因而在致病菌分析检测中具有很好的发展前景。目前，以PCR为基础的技术，如嵌套式PCR、RT-PCR、DNA指纹图谱技术、实时荧光定量PCR和其他扩增技术，已比较成功地应用于食源食源性致病菌的筛选和鉴定。 本项目针对目前国内外的食品卫生标准，以食品中常见的3种食源性致病菌——大肠杆菌、沙门氏菌、单增李斯特菌为研究对象，分别用各自的特异性引物进行三种菌的单独PCR，之后将三种菌两两组合进行双重PCR以及三种菌同时进行三重PCR扩增，验证引物的特异性，不断优化PCR反应体系，建立对沙门氏菌、大肠杆菌、单增李斯特菌的RCR 快速检验方法。该方法可以3小时内在同一PCR管中同时快速、灵敏及特异检测大肠杆菌、沙门氏菌、单增李斯特菌，可推广应用于食品卫生监督、环境监测、水源检测、商品检验检疫等领域。
