基本信息
- 项目名称：
- 应用酵母双杂交系统筛选龙须菜热激信号传导途径的钙调素结合蛋白
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 龙须菜是一种重要产琼胶海藻，已成为我国第三大海藻栽培物种。选育龙须菜耐高温品种和研究其耐高温机制一直是研究者迫切需要解决的问题。很多研究表明钙调素相关蛋白参与调节植物适应热激和耐热性的反应，而CaM结合蛋白是探明其机制的关键。本作品应用酵母双杂交系统筛选龙须菜热激信号传导的钙调素结合蛋白，为阐明龙须菜热激信号传导的钙调素途径奠定基础，对于选育耐高温品系，应对海水温度升高带来的不利影响具有重要意义。
- 详细介绍：
- 海藻栽培业是我国海水养殖业的重要组成部分，它直接受到养殖生态环境变化的影响。近年来由于温室效应引起的全球温度升高、人类活动的影响等，导致海水温度升高，在高温胁迫下，海藻各种生理代谢过程都会受到影响，严重的甚至干扰海藻的正常生长、发育，进而导致腐烂死亡。 很多研究表明钙调素（CaM）相关蛋白参与调节植物适应热激和耐热性的反应,由于CaM本身并无酶功能，所以不能直接调节生理生化过程，因此在CaM信号传导链中钙调素的下游必然存在能被钙调素调控的酶蛋白或结构蛋白，才能完成相应的生理生化反应。CaM结合蛋白（CaM-binding proteins，CaMBPs）作为钙调素直接结合和作用的靶蛋白，是CaM信号传导链中的重要组成因子。因此，研究CaMBPs有助于探明CaM信号传导链的作用机制。 在藻类中，关于CaM信号系统的研究目前非常少，而藻类热应激过程中CaM结合蛋白的分离和筛选目前尚未见报道。 龙须菜（Gracilaria lemaneiformis Bory）属红藻门(Rhodophyta)、江蓠属(Gracilaria)，产于山东沿海，是一种重要产琼胶海藻。琼胶是食品、化工和医药等产业不可缺少的原料，目前还不能人工合成，只能从龙须菜中提取。龙须菜栽培业在本世纪取得了长足发展，已成为我国继海带和紫菜之后的第三大海藻栽培物种。但是野生型龙须菜只能在11-23°C生长繁殖，栽培期短。耐高温品种981栽培期延长，但夏季在南方长势差，易发病，需要移植到北方度夏。选育龙须菜耐高温品种和研究其耐高温机制成为研究者迫切需要解决的问题。 本作品应用酵母双杂交系统筛选龙须菜热激信号传导的钙调素结合蛋白，为阐明龙须菜热激信号传导的钙调素途径奠定基础，对于选育耐高温品系，应对海水温度升高带来的不利影响具有重要意义。 提取高温胁迫下的龙须菜mRNA，反转录得到cDNA，构建pGADT7-cDNA AD文库质粒导入Y187酵母菌菌株；PCR扩增龙须菜钙调素（CaM）的开放阅读框，构建诱饵质粒pGBKT7-CAM BD，测序正确后导入Y2H Gold酵母菌株。实验结果表明二者表达产物对酵母均无毒性作用，且对报告基因均无自激活作用。将酵母菌Y187/ pGADT7-cDNA与酵母菌Y2HGold/pGBKT7- CaM进行交配转化，在SD/–Trp/-Leu/Aba/X-α-Gal平板上筛选阳性克隆，选取200个蓝色阳性克隆PCR后测序，比对编码框正确克隆的测序结果，发现其主要为蛋白酶或分子伴侣。选取180号克隆CaMBP180，克隆并拼接得到其 cDNA序列全长，编码540个氨基酸，含完整的myo-inositol 1-phosphate synthase（肌醇1-磷酸合成酶，MIPS）结构域，推测其为龙须菜的MIPS，在龙须菜热激信号转导途径中将通过与钙调素结合来调控细胞对热刺激的应答。
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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 本作品在克隆得到龙须菜钙调素cDNA全长序列的基础上，应用酵母双杂交统筛选龙须热激信号传导途径的钙调素结合蛋白。为研究龙须菜热激信号传导途径，从分子水平阐明龙须菜对高温胁迫的响应机制奠定基础。
科学性、先进性及独特之处
- 钙调素（CaM）相关蛋白参与调节植物适应热激和耐热性的反应,研究CaMBPs有助于探明CaM信号传导链的作用机制。在藻类中，关于CaM信号系统的研究目前非常少，尤其是藻类热应激过程中CaM结合蛋白的分离和筛选目前尚未见报道。
应用价值和现实意义
- 本作品研究海藻的高温胁迫响应机制，对于选育耐高温品系，应对海水温度升高带来的不利影响具有重要意义。
学术论文摘要
- 提取高温胁迫下的龙须菜mRNA，反转录得到cDNA，构建pGADT7-cDNA AD文库质粒导入Y187酵母菌菌株；PCR扩增龙须菜钙调素（CaM）的开放阅读框，构建诱饵质粒pGBKT7-CAM BD，测序正确后导入Y2H Gold酵母菌株。实验结果表明二者表达产物对酵母均无毒性作用，且对报告基因均无自激活作用。将酵母菌Y187/ pGADT7-cDNA与酵母菌Y2HGold/pGBKT7- CaM进行交配转化，在SD/–Trp/-Leu/Aba/X-α-Gal平板上筛选阳性克隆，选取200个蓝色阳性克隆PCR后测序，比对编码框正确克隆的测序结果，发现其主要为蛋白酶或分子伴侣。选取180号克隆CaMBP180，克隆并拼接得到其 cDNA序列全长，编码540个氨基酸，含完整的myo-inositol 1-phosphate synthase（肌醇1-磷酸合成酶，MIPS）结构域，推测其为龙须菜的MIPS，在龙须菜热激信号转导途径中将通过与钙调素结合来调控细胞对热刺激的应答。
获奖情况
- Screening of calmodulin-binding proteins of Gracilaria lemaneiformis under heat stress in signal-transduction by Yeast Two-hybrid System. Journal of Phycology (In press)
鉴定结果
- 我们筛选到的主要为蛋白酶，包括MIPS、cysteine protease、citroyl synthetase/过氧化物酶及酪氨酸磷酸酶等，与文献中CaMs作用原理基本一致。MIPS首次发现并验证。
参考文献
- 技术：酵母双杂交系统 生物技术 参考文献： [1]Thomas A., DEFALCO, Kyle W., BENDER, Wayne A., SNEDDEN. Breaking the code: Ca2+ sensors in plant signaling.Biochem. J.2010, 425: 27–40. [2]Min Chul Kim1, Woo Sik Chung, Dae-Jin Yun, Moo Je Cho. Calcium and calmodulin-mediated regulation of gene expression in plants.Molecular Plant.2009,2(1 ): 13–21. [3] Shen X. C., Alexander Valencia C., Szostak J. W., Dong B., Liu R. H. Scanning the human proteome for calmodulin-binding proteins. Proc. Nat1. Acad. Sci. USA. 2005, 102(17): 5969-5974. [4]Kim,H.S.,et al. Identication of a calmodulin-binding NAC protein as a transcriptional repressor in Arabidopsis. J.Biol.Chem. 2007,282:36292–36302. [5] Liu HT, Li GL, Chang H, Sun DY, Zhou RG, Li B. Calmodulin-binding protein phosphatase PP7 is involved in thermotolerance in Arabidopsis. Plant Cell Environ. 2007, 30(2): 156-164. [6] 李冰, 周人纲. 钙-钙调素信号系统参与热激信号转导的研究. 西北植物学报. 2004, 24(7): 1322-1328. [7] 毛国红, 宋林霞, 孙大业. 植物钙调素结合蛋白研究进展. 植物生理与分子生物学学报. 2004, 30(5): 481-488.
同类课题研究水平概述
- 很多研究表明钙调素（CaM）相关蛋白参与调节植物适应热激和耐热性的反应,由于CaM本身并无酶功能，所以不能直接调节生理生化过程，因此在CaM信号传导链中钙调素的下游必然存在能被钙调素调控的酶蛋白或结构蛋白，才能完成相应的生理生化反应。CaM结合蛋白（CaMBPs）作为钙调素直接结合和作用的靶蛋白，是CaM信号传导链中的重要组成因子。因此，研究CaMBPs有助于探明CaM信号传导链的作用机制。 从80年代末开始，许多实验室都试图分离植物CaMBP基因，使用了很多不同方法包括蛋白纯化、抗体筛选文库、酵母双杂交分析、蛋白芯片筛查以及凝胶阻滞分析等。在植物体中已经分离和鉴定了的CaMBPs包括NADKase，Ca2+ -ATPase，核内NTPase等，但是目前分离到的CaMBPs大多是与植物生长发育相关的，而与热激相关的CaMBPs并不多。Liu等2007年从拟南芥中分离了磷酸酶PP7，采用酵母双杂交检测PP7蛋白能够与CaM结合，并且能与HSF相互作用，敲除PP7基因的拟南芥耐热性能明显下降。 在藻类中，关于CaM信号系统的研究目前非常少，仅见莱茵衣藻（No. M20729）、团藻（No. X97199）、条斑紫菜（No. EF375999、EF368215）、海带（No. AB299381）、巨藻（No. X85091）、念珠藻（No. AY064400）等一些藻类中报道了CaM的cDNA序列，念珠藻葛仙米中研究了Ca2+-CaM在藻殖段分化过程中的作用，茅云翔等克隆了条斑紫菜中的CaM序列，并研究了其在失水胁迫下的表达情况。而藻类热应激过程中CaM结合蛋白的分离和筛选目前尚未见报道。 龙须菜是一种重要产琼胶海藻。琼胶是食品、化工和医药等产业不可缺少的原料，目前还不能人工合成，只能从龙须菜中提取。龙须菜已成为我国继海带和紫菜之后的第三大海藻栽培物种。但是野生型龙须菜只能在11-23°C生长繁殖，栽培期短。耐高温品种981栽培期延长，但夏季在南方长势差，易发病，需要移植到北方度夏。选育龙须菜耐高温品种和研究其耐高温机制成为研究者迫切需要解决的问题。 本作品应用酵母双杂交系统筛选龙须菜热激信号传导的钙调素结合蛋白，为阐明龙须菜热激信号传导的钙调素途径奠定基础，对于选育耐高温品系，应对海水温度升高带来的不利影响具有重要意义。
