基本信息
- 项目名称：
- 刺松藻硫酸酯多糖抗血小板聚集及抗血栓形成的实验研究
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 刺松藻（Codium Fragile）为藻类植物松藻科的嫩藻体。藻体黑绿色，海绵质，幼体被白色。刺松藻性味甘咸寒，中医认为，具有清热解毒、消肿利水、驱虫的功效。用于水肿、小便不利等，并具降血脂、抗凝血，抑菌，免疫调节、抗肿瘤、抗病毒等多重药理活性。本实验从刺松藻体壁中提取刺松藻多糖，从不同角度研究刺松藻硫酸酯多糖抗血小板聚集及抗血栓方面的作用，为进一步揭示其抗凝血的规律，以期对其临床应用提供依据
- 详细介绍：
- 刺松藻（Codium Fragile）为藻类植物松藻科的嫩藻体，又名鼠尾藻、刺海松、软软菜等。藻体黑绿色，海绵质，幼体被白色。刺松藻性味甘咸寒，中医认为，具有清热解毒、消肿利水、驱虫的功效。用于水肿、小便不利等，并具降血脂、抗凝血，抑菌，免疫调节、抗肿瘤、抗病毒等多重药理活性。本实验从刺松藻体壁中提取刺松藻多糖，从不同角度研究刺松藻硫酸酯多糖抗血小板聚集及抗血栓方面的作用，为进一步揭示其抗凝血的规律，以期对其临床应用提供依据。 1.材料与方法 1.1材料 1.1.1 药品与试剂 APTT试剂盒、PT试剂盒、TT试剂盒（上海太阳生物技术公司）、枸橼酸钠、阿司匹林、肾上腺素、胶原蛋白（sigma）、二磷酸腺苷（ADP）（Amresco）。 刺松藻硫酸多糖制备：刺松藻2009年4月间采自大连海域，经辽宁师范大学生命科学学院王宏伟教授鉴定为Codium fragile。多糖提取采用热水浸提乙醇沉淀法：新鲜藻体洗净，匀浆后，按1︰2加入蒸馏水，90°C浸提5h，过滤，藻渣重复提取一次，合并两次滤液，减压浓缩至原体积的1/5，三氯乙酸除蛋白，3 000 r/min离心20min，上清液加入乙醇至终浓度70%，静置过夜，离心3 000 r/min，20min，多糖沉淀以少量蒸馏水重悬，冷冻干燥得刺松藻多糖（C. fragile polysaccharides，CFPS），为白色粉末。采用硫酸-苯酚法测定总糖含量为35.11%，BaCl2-明胶比浊法测得硫酸根含量为9.02%。 1.1.2 实验动物 新西兰白兔，体重2.5～3.5kg，雌雄不限；昆明小鼠（清洁级），雌雄各半，6～8周龄，体重(20±2)g，由大连医科大学实验动物中心提供。 1.1.3 实验仪器 FD-1真空冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司；酶标仪：Thermo Election Corporation；LBY-NJ 2 血液凝聚仪(北京普利生科贸集团)；离心机。 1.2 体外抗凝血实验 新西兰白兔心脏取血，与抗凝剂枸橼酸钠按9﹕1比例混匀，3 000 r/min离心15 min，收集上层。将待测血浆分成4份，分别与不同浓度多糖药物的混合血浆测定凝血活酶时间（APTT），凝血酶原时间（PT），凝血酶时间（TT）。 1.2.1 APTT测定 取混合血浆(37℃孵育3 min)，取0.1ml加入EP管，加入37℃预温5 min的APTT试剂0.1ml混合，37℃孵育5 min后，加入已预温的CaCl20.1ml，混合后自动记录血浆凝固时间，即为待测血浆的APTT。 1.2.2 PT测定 取混合血浆(37℃孵育3 min) 0.1ml，加入37℃预温5 min的PT试剂0.2ml，混合后自动记录血浆凝固时间， 即为待测血浆的PT。 1.2.3 TT测定 取混合血浆(37℃孵育3 min) 0.2ml于测试槽中，加入已孵育好的TT试剂0.2ml，混合后自动记录血浆凝固时间， 即为待测血浆的TT。 1.2.4 凝血时间(CT)测定 凝血时间检测分5组，每组设6个平行实验，每试管先行分别加入生理盐水、1 mg/mL、2 mg/mL、4mg/mL刺松藻多糖，注射用肝素0.1ml，新西兰白兔心脏取血，立即加入每试管中0.5ml，记录凝血时间。 1.3 血小板聚集实验 健康新西兰白兔心脏采动脉血，0.109 mol/L枸橼酸钠抗凝(1∶9)。室温下1000 r/min，离心10min，收集上清为富血小板血浆(PRP) ； 余液继续以3000 r/min 离心15min，上清为制贫血小板血浆（PPP)。用PPP调PRP血小板计数为3×105 /μl。设阴性对照组： PRP 200 μl + 生理盐水10 μl； 阳性对照组： PRP 200 μl + LAS 10 μl；实验组： PRP 200μl + 刺松藻多糖10μl。37 ℃预热2 min 后，加入ADP 10μl (终浓度3μmol/l )启动血小板聚集反应，浊度法测定血小板5 min 最大聚集率，血小板聚集测定2 h内完成，计算血小板聚集抑制百分率。 血小板聚集抑制率= (阴性对照组血小板聚集率- 实验组血小板聚集率)/阴性对照组血小板聚集率×100% 1.4 体内诱导小鼠血栓形成实验 胶原蛋白和肾上腺素都是血小板聚集诱导剂小鼠静脉注射后诱发体内肺栓塞，血栓形成，导致偏瘫和死亡。这种实验是筛选和评价潜在血小板纤维蛋白原受体拮抗剂的合适的体内模型。 小鼠16只随机分为4组，每组4只：模型组(蒸馏水10ml/kg) ，小、中、大三个剂量组(0.1、0.2、0.4g/kg) 。连续灌胃7 天，灌胃体积为10ml/kg。末次给药后1h，尾静脉注射肾上腺素-胶原蛋白混和液0.05ml/10g体重，观察小鼠5分钟内死亡率。 1.5 统计学分析 采用SPSS10.0 统计软件完成数据处理，数据以表示，组间采用t 检验判断均数差异的显著性。 2 结果 2．1 刺松藻多糖体外抗凝血 与空白对照组比较， 刺松藻硫酸酯的浓度为500μg∙mL-1时， 即可显著延长凝血时间TT、CT 和APTT， 当浓度2mg∙mL- 1时， CT明显延长， 但PT 在实验浓度范围内未明显延长。 2.1.1 刺松藻多糖对APTT的影响 刺松藻多糖对APTT的影响 实验结果表明，刺松藻多糖125μg/mL， 250μg/mL，500μg/mL，1000μg/mL体外明显延长家兔APTT，差异有显 著性。 2.1.2 刺松藻多糖对PT的影响 结果表明，刺松藻多糖125μg/mL，250μg/mL，500μg/mL，1000μg/mL剂量范围内，有较好的延长PT作用，呈一定的剂量依赖关系。 2.1.3 刺松藻多糖对TT的影响 刺松藻多糖显著延长家兔凝血酶时间TT，浓度大于250μg/mL时，效果更为显著( P < 0.001)，呈剂量依赖性。 2.1.4 刺松藻多糖对家兔凝血时间的影响 刺松藻多糖各剂量组体外均可明显延长家兔CT，有剂量依赖关系。肝素亦明显延长CT。 2.2 刺松藻多糖对家兔血小板聚集的影响 实验结果表明，刺松藻多糖可抑制血小板聚集率，随多糖浓度增加，血小板聚集率呈明显下降趋势。取对最大聚集度的抑制率作为参数，结果显示刺松藻多糖呈剂量依赖方式抑制ADP诱导的血小板聚集作用。 2.3刺松藻多糖对小鼠体内血栓的影响 刺松藻硫酸酯多糖对胶原蛋白-肾上腺素所引起的小鼠体内血小板聚集有抑制作用，从而抑制其体内血栓的形成，能降低了小鼠5分钟死亡率。 3 讨论 凝血过程是一个多因子参与的复杂过程，既可由血管内膜损伤激活的“内源途径”引发；也可由血管外的凝血因子与血液接触而启动的“外源途径”引发，但它们最后都通过激活凝血因子X完成凝血过程。凝血时间和凝血酶原时间可分别反映内凝和外凝系统的功能状况。本研究采用刺松藻提取出的硫酸酯多糖，分别通过体内体外试验对其抗凝作用进行研究：1.在体外实验中发现刺松藻多糖在CT、APTT、PT、TT等实验中具有明显的抗凝作用且具有剂量依赖性。2.在体内试验中刺松藻硫酸酯多糖对胶原蛋白-肾上腺素所引起的小鼠体内血小板聚集有抑制作用，从而抑制其体内血栓的形成，降低了小鼠死亡率。因此，刺松藻多糖在对内源性外源性凝血都有明显的抑制作用。 海洋中有着种类繁多的生物，近年来随着对海洋生物的研究不断增多，不断发现具有同陆生生物相比在某些方面更加有效的海洋生物提取物，寻找出具有高效无毒低副作用的海洋药物已成为天然药物研究的新领域。 海洋生物提取物中多糖类物质有着生物活性高，毒副作用小的特点，目前对多糖的药理研究，多集中在抗肿瘤、抗病毒、免疫调节方面，而对多糖的抗凝血方面的研究相对较少。且具有抗凝血多糖来源主要为动物、褐藻、真菌。刺松藻所属的绿藻门的研究较少，本实验中采用的刺松藻多糖，是一种硫酸化多糖；硫酸多糖因其具有较强阴离子性，一般表现为不同程度的抗凝血性，具有明显的抗凝血活性，有很大潜力开发成抗血栓药物，然而，若要明确刺松藻多糖的抗凝作用机制及其药理作用，尚需深入探究。
作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 目的：提取刺松藻多糖，研究其抗血小板聚集及抗血栓作用，为制造纯天然抗凝血药物临床应用提供依据 基本思路：本实验采用热水浸提-乙醇沉淀法提取刺松藻多糖；体外实验，家兔心脏采血，观察刺松藻硫酸酯多糖对凝血时间、凝血酶原时间、活化部分凝血激酶时间、凝血酶时间的影响；采用红外比浊法测定刺松藻多糖对血小板聚集的影响;动物实验，小鼠体内血栓模型，给药观察小鼠死亡率。分析其抗血小板聚集及抗血栓形
科学性、先进性及独特之处
- 凝血时间和凝血酶原时间可分别反映内凝和外凝系统的功能状况。本研究采用刺松藻硫酸酯多糖，分别通过体内体外试验对其抗凝作用进行研究：1,体外实验发现刺松藻多糖CT、APTT、PT、TT实验中具有明显的抗凝作用且具有剂量依赖性;2,体内试验对胶原蛋白-肾上腺素引起的血小板聚集有抑制作用，从而抑制其体内血栓形成，降低了小鼠死亡率。因此，刺松藻多糖在对内源性外源性凝血都有明显的抑制作用。
应用价值和现实意义
- 海洋生物提取物中多糖类物质有着生物活性高，毒副作用小的特点，目前国内对多糖的药理研究，多集中在抗肿瘤、抗病毒、免疫调节方面，而对多糖的抗凝血方面的研究相对较少。本实验中采用的刺松藻多糖，是一种硫酸化多糖；硫酸多糖因其具有较强阴离子性，一般表现为不同程度的抗凝血性，具有明显的抗凝血活性，有很大潜力开发成抗血栓药物，然而，要明确刺松藻多糖的抗凝作用机制及其药理作用,尚需深入探究。
学术论文摘要
- 目的: 研究刺松藻硫酸酯多糖抗血小板聚集及抗血栓形成。方法: 家兔心脏采血，通过对凝血指标: 凝血时间(CT)、凝血酶原时间(PT )、活化部分凝血激酶时间(APTT )、凝血酶时间(TT ) 的观察其抗凝血活性的量效性, 研究刺松藻硫酸酯多糖的抗凝血活性；采用红外比浊法测定刺松藻多糖对血小板聚集的影响;小鼠尾静脉注射胶原蛋白-肾上腺素混合液，造成体内血栓模型，给药观察小鼠5分钟内死亡率。结果: 刺松藻多糖能显著延长家兔血浆CT、APTT、PT和TT；显著抑制由二磷酸腺苷（ADP）引起的家兔血小板聚集;显著降低小鼠5分钟内的血栓致死率。结论：刺松藻多糖具有抗凝血作用。
获奖情况
- 辽宁省大连医科大学
鉴定结果
- 无
参考文献
- [1] 李熙宜，霍玉书，陈革.中国辽东半岛40种药用海藻资源简介[J].中国海洋药物， 1994 ，13 (3) ：50-54. [2] Marina Ciancia，Irene Quintana ， Mar´ıa Isabel Vizcarg¨u´enaga，et al. Polysaccharides from the green seaweeds Codium fragile and C. vermilara with controversial effects on hemostasis[J].Int J Biol Macromol， 2007，41(5)： 641-649. [3] Yasantha Athukorala， Ki-Wan Lee， Se-Kwon Kim，et al. Anticoagulant activity of marine green and brown algae collected from Jeju Island in Korea[J]. Bioresource Technol，2007， 98 (9)：1711-1716. [4] 闫冰，等.海参多糖的生物活性研究概况.药物实践杂志[J].2004， 22(2)： 101-103 [5] A. V. Basanova， I. P. Baskova Vascular–Platelet and Plasma Hemostasis Regulators from Bloodsucking Animals.2002， pp. 143-150 [6] 谢露，黎静 海带多糖L01抑制血小板活性与血管内皮细胞保护作用 中国病理生理杂志 2007， 23 (4) ： 674 - 677 [7] 施松善，翁颖琦等 长叶蜈蚣藻多糖抗凝血活性的研究 中国海洋药物杂志 2008年8月 27（4）：21-23 [8] 徐恒启，陈克利 国内抗凝血、抗血栓多糖的药理研究进展 生物学杂志第22 卷第1 期 2005，Feb；22（1）14-16
同类课题研究水平概述
- 全世界的藻类约3万余种，包括红藻、绿藻和褐藻3大类，其中，褐藻和红藻已经被大规模的人工养殖和工业利用，而绿藻则未被广泛开发和利用，只有部分产量高的绿藻被用作饲料、饵料、肥料等。然而，绿藻却是种类最多的一类海藻，是藻类植物中最大的一门，约有350个属，7500~8000种。在对于海藻的活性物质的研究中，褐藻以及红藻较多，其中由褐藻中提取的褐藻硫酸酯多糖的生物活性及作用经过近七十年的研究已经十分全面，而对于绿藻的研究尤其是其抗凝血活性的研究仅从上世纪八九十年代才开始出现。 目前，已发现多种绿藻多糖具有抗凝血活性。Matsubara等从Codi-cylindricum中提取的多糖表现出了类似肝素的活性，能够显著延长APTT和凝血酶时间(TT)时间。Hayakawa等从8种绿藻中提取到8种多糖，全部表现出抗凝血活性，这8种绿藻分属于松藻属、石莼属和礁膜属，多糖通过依赖于肝素辅助因子II的途径抑制凝血酶，其抗凝血作用机制不同于肝素。松藻Codium dwarkenseBoergs和Codium tomentosum (Huds．)Stackh 的冷水提取物具有抗凝血活性。Ghosh等研究发现当蕨藻Caulerpa racemosa多糖能使APTT和TT值显著延长。另外，Kweon也证明松藻属海藻多糖可显著延长活化部分凝血活酶时间(APTT)时间。 经过近二十年的研究，国内外研究者对一些绿藻中提取的多糖的研究取得一定进展，得出部分绿藻的主要活性成分，并对这些成分的作用进行初步研究。研究表明绿藻的活性成分主要为硫酸阿拉伯聚糖或硫酸鼠李聚糖。其作用机制主要是通过加强抗凝血酶Ⅲ和肝素辅助因子Ⅱ起作用，或者直接抑制凝血酶活性和纤维蛋白聚合，是重要的内生抑制剂。但是绿藻多糖抗凝血活性会受到各方面影响，环境温度，品种，以及提取方式等。而目前对绿藻中多糖研究的文献较少，提取方式不同其作用的成分也不尽相同。 刺松藻属绿藻门松藻属，目前有关刺松藻的研究在国内较少，其抗凝血的研究未见相关报道。有关动物体内体外的研究方法在其他藻类多糖的研究中也少见报道。
