基本信息
- 项目名称：
- 牙髓炎疼痛相关因子CGRP的动态表达及作用研究
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 牙髓是富含神经纤维的组织，牙髓炎症在很大程度上属于神经源性所介导的炎症，神经系统在牙髓的炎症及修复过程中起着不可低估的作用。 本研究利用大鼠牙髓炎动物模型，观察牙髓炎大鼠半月神经节及牙髓中CGRP的表达变化，探讨CGRP参与牙髓病理改变的信号调节作用，为深入研究神经系统参与牙髓的各种生理、病理改变的调节提供实验参考，为进一步阐明牙髓炎疼痛机制、积极开发牙髓炎防治新靶点提供新的思路和理论依据。
- 详细介绍：
- 一、研究背景： 牙髓炎是口腔临床常见病症，阵发性剧痛为患者就诊的最常见主诉。研究表明，牙髓是一种富含神经纤维的组织，这些神经纤维来源于三叉神经节初级感觉神经元，含有P物质(SP)、降钙素基因相关肽(Calcitonin Gene-Relatcd Pepide, CGRP)、神经激肽A等神经肽[1]。有学者认为，神经肽可通过调节神经与血管的活动而参与牙髓急慢性炎症过程，因此牙髓炎症在很大程度上是属于神经源性所介导的炎症[2]。 CGRP主要分布于传导痛觉的无髓鞘的C神经纤维和细髓鞘的Aδ神经纤维，人的恒牙牙髓组织中，其阳性纤维呈束状进入根尖孔，分布于整个牙髓组织中[3]。CGRP是一种多功能生理调节肽，在体内作用广泛。首先，它作为神经递质将感觉信息传递给中枢神经系统，是痛觉和痛觉过敏产生的必需物质[4]。此外，CGRP作为舒血管物质，具有明显的血管扩张作用。它还可以增强SP的浆液外渗效应，对组胺、缓激肽等引起的血管通透性增加有放大效应[5-6]。近年来研究表明，感觉传导神经除了将疼痛信息向中枢方向传导外，还有逆传导功能，通过神经纤维向外周组织释放CGRP等神经活性物质，在局部组织中发挥生物学效应。最近的研究发现，牙髓组织中免疫活性细胞如巨噬细胞与CGRP 和SP 神经纤维非常接近，并可见细胞与神经末梢膨大处的接触[7]，提示牙髓细胞中存在着神经与免疫系统的相互作用。因此, 神经系统在牙髓的炎症及修复过程中起着不可低估的作用。 本实验利用大鼠牙髓炎实验模型，应用免疫荧光及免疫组化法观察牙髓炎大鼠TG神经元及牙髓神经纤维CGRP的表达变化，探讨疼痛相关因子CGRP参与牙髓病理改变的信号调节作用，为深入研究神经系统参与牙髓的各种生理、病理改变的调节提供实验参考。为进一步阐明牙髓炎疼痛机制、积极开发牙髓炎防治新靶点提供新的思路和理论依据。 参考文献： [1]. 牙髓组织中降钙素基因相关肽和P 物质的研究现状，郝作琦等，牙体牙髓牙周病学杂志，2001;11(5):345-347. [2]. Kim S, Neurovascular interactions in the dental pulp in health and in-flammation, J Endodont, 1990; 16 (2):48. [3]. Egan CA. On the pulpal nerve supply in primary human teeth :evidence for the innervation of primary dentine, Int J Paediatr Dent , 1999; 9 (1) :5 7. [4]. Seybold V.S, The role of peptides in central sensitization, Handb Exp Pharmacol 2009; (194): 451-91. Review [5]. 咬合重建大鼠三叉神经节CGRPmRNA 及其相应蛋白的表达研究，李晓光等, Journal of Oral Science Research, 2010; 3 (26): 312-315. [6]. Le Bars D, Adam F, Nociceptors and mediators in acute inflammatory pain,Ann Fr Anesth Reanim. 2002;21 (4): 315-335, Review. [7]. Okiji T, Jontell M, Belichenko P, et al., Structural and functional association between substance P and Calcitonin gene-related peptide immunoreactive nerves and accessory cells in the rat dental pulp, J Dent Res , 1997; 76 (12) :1818. 二、主要研究内容： 1、建立大鼠牙髓炎动物模型 髓腔直接暴露及根管内封入完全弗氏佐剂（Freund's Adjuvant Complete, CFA，两种方法建立SD（Sprague-Dawley）大鼠牙髓炎模型。 1.1 髓腔直接暴露法： 麻醉大鼠，消毒实验动物，高速涡轮牙钻（水冷却下）将右侧下颌第一磨牙牙合面开髓，髓腔自然暴露。 1.2 CFA诱导法： 按髓腔直接暴露法将右侧下颌第一磨牙牙合面开髓，生理盐水冲洗、吸干后，将浸有CFA液（CFA:生理盐水，2:1）的棉尖置入髓腔，暂封。 2、应用间接免疫荧光法和免疫组化方法检测CGRP表达 2.1 标本的制备： 4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液经左心室灌流固定动物。剖取TG用相同固定液后固定，20%蔗糖隔夜浸润后，制备片厚10μm的TG连续冰冻切片；剖取下颌骨，去除骨表面软组织，中线处纵行分离，修整为包含第一、二、三磨牙的长方形骨块，置入4.13％的EDTA磷酸盐缓冲液中脱矿3周，20%蔗糖隔夜浸润后，沿骨块长轴纵行切片制备12μm厚的牙髓冰冻切片。 2.2 间接免疫荧光法及免疫组织化学染色： 取经上述方法处理的一组切片，PBS液清洗后加入含0.3％H2O2的甲醇溶液，室温下处理30 min固定组织并灭活内源性过氧化物酶，PBS清洗后滴加正常山羊血清封闭液，室温下孵育30min。滴加兔抗大鼠CGRP抗体（1:5000），4℃过夜（阴性对照组以等量PBS替代一抗）。PBS清洗后加入CY3标记的山羊抗兔IgG（1:200），避光孵育1h。PBS漂洗后滴加DAPI（1ug/ml）工作液，细胞核染色5分钟，PBS充分漂洗后荧光封片剂封片，Olympus BX-51TF荧光显微镜下观察。 免疫组织化学染色简述如下，一抗兔抗大鼠CGRP抗体浓度采用1:10000，SP免疫组化试剂盒代替荧光素标记的IgG，硫酸镍铵葡萄糖氧化酶加强的DAB进行显色，梯度酒精脱水，透明，封片，光学显微镜下观察，其余过程间接免疫荧光法。 3、应用逆转录RT-PCR(Reverse Transcription-PCR)及实时定量PCR (Quantitative Real-Time PCR,QPCR)方法从mRNA水平检测CGRP表达的变化 选取代表性时间点断颈法处死动物，无菌条件下快速剖取TG，异硫氰酸胍一步法提取总RNA，逆转录反应合成cDNA第一链。PCR法扩增CGRP分子的目的片断，产物经常规琼脂糖凝胶电泳。进一步应用TaqMan 实时定量QPCR技术精确定量各mRNA水平并记录时程变化。 三、拟解决的关键科学问题 1、解析牙髓炎大鼠TG神经元及牙髓神经纤维CGRP的表达变化。 2、探讨疼痛相关因子CGRP参与牙髓病理改变的信号调节作用。 3、为深入研究神经系统参与牙髓的各种生理、病理改变的调节提供实验参考。 4、为进一步阐明牙髓炎疼痛机制、积极开发牙髓炎防治新靶点提供新的思路和理论依据。
作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 目的：观察牙髓炎大鼠TG及炎症牙髓中CGRP的分布，深入探讨神经系统参与牙髓病理改变的信号调节作用。 基本思路：本研究拟构建弗氏佐剂诱发的大鼠牙髓炎动物模型，应用免疫组织化学染色、RT-PCR等现代分子生物学实验技术深入解析疼痛相关因子CGRP的分子表达及分布，为进一步阐明牙髓炎疼痛机制、积极开发牙髓炎防治新靶点提供新的思路和理论依据。
科学性、先进性及独特之处
- 本课题选题新颖，具有口腔医学特色。本研究将从分子水平对疼痛相关因子在牙髓炎疼痛中的动态角色予以阐明，探讨牙髓炎疼痛机制、发掘镇痛靶点，为深入研究神经系统参与牙髓的各种生理、病理改变的调节提供实验参考。本研究结果可以填补这一研究领域的空白，为急、慢性牙髓炎的临床治疗提供新的实验参考和理论依据。
应用价值和现实意义
- 牙髓炎症所诱发的自发性疼痛给患者带来极大的痛苦，然而引起牙痛的病因多样，疼痛的发病机制不清，至今缺乏有效的防治措施。本研究成果将对阐明牙髓炎疼痛机制、开发镇痛分子靶点、完善牙髓炎的临床治疗提供新的思路和理论依据，具有重要的科学价值和现实意义。
学术论文摘要
- 目的：观察牙髓炎大鼠半月神经节及炎症牙髓中CGRP的分布，探讨神经系统参与牙髓病变的信号调节作用。方法：采用完全弗氏佐剂诱导法，建立SD大鼠磨牙牙髓炎模型，应用免疫荧光、免疫组织化学染色法及图像分析技术，检测牙髓炎即刻组及7天组TG和牙髓中 CGRP的表达。结果：正常大鼠TG中小型神经元及其轴突均表达CGRP，牙髓中富含CGRP免疫反应性神经纤维。炎症刺激后TG神经元CGRP表达增强，随炎症发展而减少。炎症刺激后牙髓中CGRP阳性神经纤维减少，后呈回升趋势。结论：牙髓受炎症刺激时，TG神经元CGRP表达及牙髓内阳性神经纤维均有调控性变化，提示CGRP既与牙髓炎性痛的发生和中枢调节有关，又参与牙髓组织炎症及修复过程。
获奖情况
- 2011年四月获得大连医科大学第五届大学生课外学术科技作品竞赛三等奖
鉴定结果
- 无
参考文献
- 1、咬合重建大鼠三叉神经节CGRPmRNA 及其相应蛋白的表达研究，李晓光等, Journal of Oral Science Research, 2010; 3 (26): 312-315. 2、Okiji T, Jontell M, Belichenko P, et al., Structural and functional association between substance P and Calcitonin gene-related peptide immunoreactive nerves and accessory cells in the rat dental pulp, J Dent Res , 1997; 76(12) :1818. 3、Egan CA. On the pulpal nerve supply in primary human teeth :evidence for the innervation of primary dentine, Int J Paediatr Dent , 1999; 9 (1) :5 7. 4、牙髓组织中降钙素基因相关肽和P物质的研究现状，郝作琦等，牙体牙髓牙周病学杂志，2001;11(5):345-347. 5、Seybold V.S, The role of peptides in central sensitization, Handb Exp Pharmacol 2009; (194): 451-91. Review
同类课题研究水平概述
- 急、慢性牙髓炎在口腔临床常见多发，自发性剧痛为其主要症状及病史。然而，牙髓炎性疼痛发生的病理生理过程复杂，发病机制不清，更缺乏有效的防治措施。解析牙髓炎疼痛机制，积极探索治疗靶点，具有重要的科学价值和现实意义。 目前的研究表明，牙髓是一种富含神经纤维的组织，这些神经纤维来源于三叉神经节初级感觉神经元，含有CGRP、P物质(SP) 等神经肽。有学者认为神经肽可通过调节神经与血管的活动而参与牙髓急慢性炎症过程，牙髓炎症在很大程度上是属于神经源性所介导的炎症。研究证明，组织炎症过程中，炎细胞释放的炎性介质，一方面可引起组织的炎性反应，同时可以促进细胞膜合成并释放前列腺素和白三烯，刺激神经末梢使感受器致敏，感受器受到刺激后，产生痛觉的同时还释放神经肽CGRP等，CGRP又可以作为炎症介质直接参与炎症反应。这两者相互影响，相互联系，从而推动疾病一步步向前发展。 CGRP是一种多功能生理调节肽，在体内作用广泛。它除了作为疼痛因子发挥神经递质作用外，还作为舒血管物质具有明显的血管扩张作用。此外，CGRP还可增强SP的浆液外渗效应，对组胺、缓激肽等引起的血管通透性增加有放大效应。近年来研究进一步发现，感觉传导神经除了将疼痛信息向中枢方向传导外，还有逆传导功能，通过神经纤维向外周组织释放CGRP，在局部组织中发挥生物学效应。最近的研究发现，牙髓组织中免疫活性细胞如巨噬细胞等与CGRP 和SP 神经纤维非常接近，并可见细胞与神经末梢膨大处的接触，提示牙髓细胞中存在着神经与免疫系统的相互作用。因此, CGRP在组织损伤的炎症及修复过程中起着不可低估的作用。 本课题研究拟构建弗氏佐剂诱发的大鼠牙髓炎实验模型，应用免疫组织化学染色、RT-PCR等现代分子生物学实验技术，从分子水平观察牙髓炎大鼠TG神经元及牙髓神经纤维CGRP的动态表达及转导，探讨疼痛相关因子CGRP参与牙髓病理改变的可能机制和信号调节作用，为深入研究神经系统参与牙髓的各种生理、病理改变的调节提供实验参考。本研究成果对阐明牙髓炎疼痛机制、发掘镇痛靶点，改善和有效防治疗急、慢性牙髓炎的疼痛症状提供提供新的思路和理论依据具有重要的科学意义。
