基本信息
- 项目名称：
- 用于蛋白间互作研究的双分子荧光互补（BiFC）操作平台的构建及应用
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 科技发明制作A类
- 简介：
- 双分子荧光互补是利用绿色荧光蛋白产生的荧光验证蛋白之间的互作、检测其互作强弱以及定位蛋白互作位点的一项新技术.本研究针对已有的BiFC载体缺陷进行改造. 同时，将应用改造后载体平台对番茄CIPKs和CBLs蛋白互作展开研究，结果番茄中CBLs与CIPKs的互作并非与拟南芥完全相同，可能调控不同的抗逆反应，为进一步开展番茄CBLs与CIPKs的功能研究提供线索.
- 详细介绍：
- 双分子荧光互补（Bimolecular fluorescence complementation，BiFC）是利用绿色荧光蛋白产生的荧光验证蛋白之间的互作、检测其互作强弱以及定位蛋白互作位点的一项新技术. 本研究针对已有的BiFC载体构建过程复杂、所用工具酶为稀有酶及连接困难等问题，对BiFC进行改造. 结果表明，改造后的BiFC平台操作便利、快捷，假阳性出现机率低，可用于蛋白间互作分析. 通过该平台，进一步开展了番茄CBLs与CIPKs间互作研究，各CBLs与CIPKs组合间均能产生互作，但互作强弱程度差异较大. 特别值得关注的是，拟南芥AtCBL1与AtCIPK23互作可激活钾离子通道，但LeCBL1和LeCIPK23互作很弱，与预期不符，表明番茄中CBLs与CIPKs的互作并非与拟南芥完全相同，可能调控不同的抗逆反应，为进一步开展番茄CBLs与CIPKs的功能研究提供线索.
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作品专业信息
设计、发明的目的和基本思路、创新点、技术关键和主要技术指标
- 研究目的：本研究旨在扩展双分子荧光互补（BiFC）技术在植物分子生物学研究中的应用。 基本思路：分别克隆35S 启动子和终止子，插入到pCAMBIA1301双元表达载体合适位置，构建pCAMBIA1301-35ST载体；消除pCAMBIA1301-35ST载体中的部分酶切位点；分别以BiFC载体pSAT1-cEYFP-C1-B和pSAT4-nEYFP-C1质粒为模板，克隆相应的cEYFP盒和nEYFP盒，分别构建pCAMBIA1301-cEYFP -35ST和pCAMBIA1301-nEYFP-35ST载体。 创新点：原有的BiFC载体在构建过程中存在克隆过程复杂、所用工具酶为稀有酶，以及不易连接成功等问题，本小组的创新在于对原BiFC载体进行改造，消除原载体上的稀有酶切位点，增加实验室常用的一些限制酶切位点，便于目的基因进行荧光互补观察。 技术关键：消除pCAMBIA1301-35ST载体中的部分稀有酶切位点；增加实验室常用的一些限制酶切位点。 主要技术指标：（1）构建pCAMBIA1301-cEYFP -35ST和pCAMBIA1301-nEYFP-35ST载体，用实验室常用的一些限制酶切位点替代原载体上的稀有酶切位点。
科学性、先进性
- 蛋白质功能的表现通常通过蛋白质的相互作用完成，即某一个蛋白质的功能表型，要通过与其他蛋白质之间的相互作用来实现。蛋白互作是细胞中的一项基本生理作用，发生在所有亚细胞结构及细胞器中的每一个生理过程。目前，蛋白互作的研究已经是研究生命活动的一个热点方向。免疫共沉淀、表面等离子共振，以及酵母双杂交技术是较为传统的蛋白质互作研究手段，但不能有效开展活体研究。 利用荧光蛋白发光原理可有效检测蛋白在活体内的互作，现有双分子荧光蛋白互补 和荧光共振能量转移 两种方法。本小组在原有的BiFC技术基础上，针对其载体克隆过程复杂、所用工具酶为稀有酶，以及不易连接成功等问题开展了一系列的攻关，新的改良载体已经成功替换了稀有的工具酶，以常用的工具酶为代替，克服了不易连接成功的问题；同时载体骨架的改变也克服了克隆过程复杂，有利于实验室后续研究的进展。
获奖情况及鉴定结果
- 1. 本项目曾在2010 年参加由浙江省大学生科技竞赛委员会主办的浙江省第二届大学生生命 科学竞赛，并获得一等奖。 2. 省科技厅2010 年度浙江省大学生科技创新活动计划立项项目“双分子荧光互补技术研究番 茄CBL1 与CIPK23 的互作”（2010R404005）。 3. 本项目曾获浙江师范大学第四届“挑战杯”课外学术科技作品竞赛一等奖。
作品所处阶段
- 实验室阶段
技术转让方式
- 有偿转让
作品可展示的形式
- 图片 样品
使用说明,技术特点和优势,适应范围,推广前景的技术性说明,市场分析,经济效益预测
- 蛋白互作是细胞中的一项基本生理作用，发生在所有亚细胞结构及细胞器中的每一个生 理过程。阐明蛋白质的相互作用在何时、何地发生以及蛋白质复合物如何形成，能为确定蛋 白质生物学作用提供决定性线索。目前，蛋白互作的研究已经是研究生命活动的一个热点方 向。 BiFC 技术是近年来发展的研究目标蛋白是否具有相互作用的一项新技术。与常用的研究 蛋白互作的免疫共沉淀、表面等离子共振、酵母双杂交技术相比，BiFC 技术简单直观，无需 试剂检测，假阳性率低，从而能更好的推断出目标蛋白是否发生了相互作用。现有研究表明 BiFC 技术能广泛应用于许多结构、功能不同的蛋白互作与修饰的研究。该技术在不同实验室 也已广泛的应用于不同的细胞株与有机体，并未发现在任何实验材料系统出现不适用。本实 验小组开发的BiFC 改良载体将以载体形式转让于其他实验室，以其改良后的优势逐渐替代原 有BiFC 载体的市场。目前，蛋白互作已成为研究的热点，因而改良载体具有很好的社会效益。
同类课题研究水平概述
- 下村修等从水母体内分离纯化得到绿色荧光蛋白，马丁·查尔菲等首次在大肠杆菌中成功表达了能够产生绿色荧光的GFP。 目前，GFP的应用已经涉及分子生物学、细胞生物学以及临床医学等多个学科。作为报告基因，GFP被广泛的应用于亚细胞定位、蛋白互作等诸多体系中，成为重要的研究手段。而蛋白互作是细胞中的一项基本生理作用，利用GFP发光原理可有效检测蛋白在活体内的互作，现有双分子荧光蛋白互补和荧光共振能量转移两种方法。 BiFC是基于GFP发光原理来验证蛋白之间的互作、检测其互作强弱以及定位蛋白互作位点的一项新技术。将GFP在特定的位点切开，形成不发荧光的N端和C端，分别连接到2个有相互作用的靶蛋白，在细胞内共表达或体外混合这2个融合蛋白时，由于靶蛋白的相互作用，荧光蛋白的2个片段在空间上互相靠近互补，重新构建成完整的具有活性的荧光蛋白分子。 现有研究表明BiFC 技术能广泛应用于许多结构、功能不同的蛋白互作与修饰的研究。该技术在不同实验室也已广泛的应用于不同的细胞株与有机体，并未发现在任何实验材料系统出现不适用。 BiFC 系统虽然出现较晚，但迅速获得应用。目前双分子荧光互补标记技术在蛋白互作研究应用中 主要涉及于转录因子间的相互作用及其亚细胞定位，G 蛋白以及α 和β 亚基之间的互相作用，各类蛋白家族以及相关伴侣蛋白之间的互相作用，信号转导级联，酶-底物复合物的确定，蛋白复合物定位调节，涉及转录后修饰的互作，监视新的互作蛋白，大分子复合物和分子骨架等 。这些蛋白质在传统的研究中因为条件的限制曾存在种种猜测和质疑，但随着BiFC 技术在研究中的应用，各种猜测也渐渐地得到了解决，尤其是蛋白家族以及相关伴侣蛋白之间的互相作用的研究。传统的研究对于伴侣蛋白的研究一直存在空白，尽管存在种种迹象证明它的存在，但却没有一种直接的手段观察或提取到伴侣蛋白。利用BiFC 技术我们可以直接在荧光显微镜下观察到伴侣蛋白的生物过程，这也有利于我们对蛋白家族或群体协作的研究。 尽管BiFC 技术仍具有许多难以克服的缺陷，但我们必须承认双分子荧光互补标记技术已经为我们 蛋白质互作的研究打开了新的道路。并且随着BiFC 技术的完善，更加合适的GFP 变异的出现，蛋白 质互作的研究将会得到更好的发展。
