基本信息
- 项目名称：
- 青海湖裸鲤低氧诱导因子-1α ODD功能域P550变异研究
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 本研究通过定点突变青海湖裸鲤HIF-lα上的P550位点氨基酸，利用绿色荧光蛋白作为融合蛋白标签和报告基因的优越性，构建真核及原核表达载体，探索P550变异对ODD-eGFP融合蛋白稳定性和脯氨酸羟化酶羟化活性的影响。加深对青海湖裸鲤HIF-1α ODD功能域P550位点变异的重要性的认识，解析青海湖裸鲤HIF-1α P550变异可能是青海湖裸鲤能够适应青海湖低氧特殊高原盐湖环境的关键因素之一。
- 详细介绍：
- 作为青海湖唯一的一种经济鱼类，青海湖裸鲤能够在低氧环境下正常生存。低氧诱导因子对裸鲤在低氧环境生长有重要作用。常氧下低氧诱导因子能够被脯氨酸羟化酶羟化，其羟化序列表示为LXXLAP，其中X表示任何氨基酸，而P表示脯氨酸羟基接受体。裸鲤的低氧诱导因子HIF-lα，羟化识别序列较为特殊，是已知物种中唯一在该位点发生突变的，表示为PEMLAP(550-555)，对应人的HIF-lα ODD功能域LEMLAP(559-564)。 本研究通过定点突变P550位点的蛋白质，探索P550变异对ODD-eGFP融合蛋白稳定性和脯氨酸羟化酶羟化活性的影响。首先构建ODD(P550)-eGFP与ODD(L550)-eGFP融合蛋白的真核表达载体，利用脂质体法瞬时转染Hela细胞，荧光显微镜检测后经处理获得融合蛋白，采用荧光定量PCR和Western blot分别检测其mRNA和蛋白水平。其次，构建pET-30a-ODD(P550)-eGFP及pET-30a-ODD(L550)-eGFP原核表达载体，经镍柱纯化得到融合蛋白。克隆脯氨酸羟化酶2(prolyl hydroxylase 2, PHD2)基因，采用兔网织红细胞裂解液体系体外表达获得PHD2，并以原核表达的融合蛋白为底物进行羟化反应，Western blot鉴定两种融合蛋白羟化水平的差异。研究结果显示，低氧下ODD(P550)-eGFP的蛋白水平相比ODD(L550)-eGFP较高，经PHD2处理后，ODD(P550)-eGFP融合蛋白的羟化水平无显著变化，而ODD(L550)-eGFP则发生迁移率的差异，出现新的条带，表明青海湖裸鲤ODD功能域HIF-lα P550变异，影响青海湖裸鲤HIF-lα的羟化水平和稳定性。
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撰写目的和基本思路
- 目的：研究P550变异对HIF-1α稳定性和羟化水平的影响，为裸鲤保护和种群恢复提供依据，为培育抗逆性强的优良鱼类新品种提供新思路。 基本思路：定点突变P550位点，构建野生及突变型真核表达载体转染Hela细胞，用荧光定量PCR和Western blot检测其mRNA和蛋白水平。克隆并体外表达PHD2，与原核表达的ODD-eGFP融合蛋白进行羟化反应，经Western blot分析羟化水平差异。
科学性、先进性及独特之处
- 本研究首次揭示青海湖裸鲤HIF-1α P550位点变异影响HIF-1α的稳定性和羟化水平，为进一步阐明该变异的生理意义及可能存在的逆境适应的特殊分子机制提供依据。同时为鱼类水产养殖和基因工程培育抗逆性强的鱼类新品种提供新思路。并采用增强型绿色荧光蛋白标记目的基因，在不影响融合蛋白稳定性同时，研究因子的相关特性。首次成功克隆了PHD2基因。从真核表达和原核表达两条路线出发阐明P550变异的特殊意义。
应用价值和现实意义
- 本研究为基础理论研究。可加深对青海湖裸鲤HIF-1α ODD功能域P550位点变异的特殊性和重要性认识，解析P550变异可能是青海湖裸鲤能够适应青海湖低氧，高寒特殊高原盐湖环境的关键因素之一。通过青海湖裸鲤独特的耐低氧机制的研究，可为更好地应对水体低氧影响水产养殖这一难题在理论上提供新思路。为裸鲤保护和种群恢复提供依据。同时，也可为通过基因工程培育抗逆性强的优良鱼类新品种在理论上提供新的思路。
学术论文摘要
- 低氧诱导因子对青海湖裸鲤在低氧环境生长有重要作用。裸鲤的低氧诱导因子HIF-lα羟化识别序列是已知脊椎动物HIF-lα序列中唯一在P550位点发生突变的。 本研究通过定点突变P550位点的氨基酸，探索P550变异对ODD-eGFP融合蛋白稳定性和脯氨酸羟化酶羟化活性的影响。首先构建野生型及突变型融合蛋白的真核表达载体，瞬时转染Hela细胞，采用荧光定量PCR和Western blot分别检测其mRNA和蛋白水平。其次构建野生型及突变型融合蛋白的原核表达载体，表达得融合蛋白。克隆脯氨酸羟化酶2(PHD2)基因，体外表达获得PHD2，并以原核表达的融合蛋白为底物进行羟化反应，Western blot鉴定两种融合蛋白羟化水平的差异。结果显示，低氧下ODD(P550)-eGFP的蛋白水平相比ODD(L550)-eGFP较高，经PHD2处理后，ODD(P550)-eGFP融合蛋白的羟化水平无显著变化，而ODD(L550)-eGFP则发生迁移率的差异，出现新的条带，表明青海湖裸鲤ODD功能域HIF-lα P550变异，影响青海湖裸鲤HIF-lα的羟化水平和稳定性。
获奖情况
- 1.2010年11月，获浙江省第二届生命科学竞赛二等奖。 2.2010年12月，获浙江师范大学第四届“挑战杯”大学生课外学术科技作品竞赛一等奖。
鉴定结果
- 无
参考文献
- 1. Western blot [1] Parchi P, Notari S, Weber P, et al. Inter-Laboratory Assessment of PrPSc Typing in Creutzfeldt-Jakob Disease: A Western Blot Study within the NeuroPrion Consortium[J]. Brain Pathol, 2009, 19(3):384-391 2. 荧光定量PCR [1] Benes V, Castoldi M. Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available[J]. Methods, 2010, 50(4):244-249 3. 重叠延伸PCR [1] W. R. A. Kosala, J. S. Rajapaksha, Daoyi Wang, et al. Novel Splice Variants of Rat CaV2.1 That Lack Much of the Synaptic Protein Interaction Site Are Expressed in Neuroendocrine Cells[J]. J Biol Chem, 2008, 283(13): 15997-16003 4. 逆转录获得cDNA [1] Wang X J, Han Y X, Dang Y, et al. Moloney Leukemia Virus 10 (MOV10) Protein Inhibits Retrovirus Replication[J]. J Biol Chem, 2010, 285(15):14346-14355
同类课题研究水平概述
- 青海湖裸鲤是青海湖唯一的经济鱼类。 近几十年来，过度捕捞等因素造成其天然产卵场的破坏，导致裸鲤资源急剧下降，已基本丧失渔业价值。裸鲤的生理或分子适应机制尚未得到详细阐述。 水体溶氧量变化对鱼类生长发育影响至关重要。低氧诱导因子(hypoxia-inducible factors，HIFs)为低氧调控的核心转录因子。 低氧诱导因子-1 (HIF-1)是低氧诱导因子三种亚型中的一种，属于一种对氧敏感的转录因子超家族。HIF-1 能调控100多种基因，能根据低氧的严重程度和细胞环境情况，引起靶基因表达量不同程度的增加。 HIF-1由α和β两个亚基组成，其活性主要由HIF-1α决定。 氧依赖性降解结构域(oxygen-dependent degradation domain, ODD)位于人HIF-1α氨基酸序列401-603 区域。 低氧下，HIF-1α 保持稳定并转移到核内与β亚基聚合激活转录。常氧下，人HIF-1α上的第402和564位脯氨酸残基被脯氨酸羟化酶(prolyl hydroxylases，PHDs)羟化，随后被pVHL蛋白(von Hippe l-Lindau protein)识别，随后降解。PHD的羟化序列表示为LXXLAP，其中X可为任何氨基酸，而P表示脯氨酸羟基接受体。PHD2是PHDs三种同工酶中的一种。 在已知脊椎动物中，青海湖裸鲤HIF-1α是进化速率最快的HIF-1α基因之一，其羟化识别序列为PEMLAP(550-555)，与人HIF-lα ODD功能域LEMLAP(559-564)相比，第550位由脯氨酸P替换了保守的亮氨酸L，是目前已知HIF-lα序列的所有脊椎动物中，唯一在该位点发生变异的物种。 Huang 等实验表明，若人的HIF-lα ODD 功能域LEMLAP(559-564)中L559发生突变，PHD的识别效率会降低，HIF-lα 较稳定。Li 等的研究表明，将L559 突变成P559 会使低氧诱导因子的PHD活性降低至原来的50% 左右。而对青海湖裸鲤相对应的该序列上P550位点并未研究。因此，推测青海湖裸鲤的HIF-lα ODD功能域的氨基酸序列P550变异可能影响PHDs对裸鲤HIF-1α的识别与羟化，以及HIF-1α的稳定性，从而在青海湖裸鲤对高原盐湖环境的适应中发挥重要作用。
