基本信息
- 项目名称：
- 中国蛇岛蝮蛇毒腺cDNA文库的构建及部分ESTs分析
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 本实验在成功构建大连蛇岛蝮蛇毒腺全长cDNA文库的基础上，对部分序列进行随机克隆和ESTs测序，通过与NCBInr数据库比对、查询和注释，对获得的195个有效序列进行分析。该全长cDNA文库的构建成功以及部分ESTs序列的获得，为GSS蛋白活性组分基因的克隆、蛋白表达和功能研究奠定了基础。今后可以利用所构建的GSSG-cDNA文库，在大规模测序的基础上，进一步开展蛇岛蝮蛇功能基因的研究。
- 详细介绍：
- 一．材料与方法 1.材料与试剂 GSS由辽宁蛇岛老铁山自然保护区管理处提供；Poly (A) PuristTM 试剂盒、DNA Marker、TaKaRa RNAiso Reagent、载体、各种限制性内切酶、宿主细胞为宝生物工程(大连)有限公司产品；CreatorTM SMARTTM cDNA Library Construction Kit为Clontech公司产品。EB、苯酚为Sigma 公司；其他试剂为国产分析纯。 2.cDNA文库的构建采用SMART技术，以pDNR-LIB为载体，E. coli DH10B为宿主菌构建中国蛇岛蝮蛇毒腺的cDNA文库。 3.cDNA克隆的序列测定1.cDNA文库菌液的扩增 2.cDNA文库质粒的提取 4.ESTs的获得与分析 获得的文库质粒序列用Chromas 剔除pDNR-LIB载体序列以及包含的接头序列，得到每个克隆的EST序列信息，再通过Stackpack软件将获得的序列进行拼接，获得UniGenes，通过NCBInr蛋白质数据库进行Blast X检索和序列比对，分析基因的功能并将其分类，对应的克隆保存、备用。 二．结果与分析 1. cDNA文库质量检测 以pDNR-LIB为载体，构建了GSSG-cDNA文库，其原始文库库容量为8×107 cfu/mL，随机从文库中挑选单菌落进行菌液PCR鉴定表明，大多数插入片段均大于1000 bp，表明所构建的cDNA文库是高质量的。这是我国第一个GSSG-cDNA文库。 2. cDNA文库质粒鉴定 cDNA文库用碱裂解法提取质粒，经1%琼脂糖凝胶电泳检测。所得到的电泳图表明我们已构建了完整的GSSG-cDNA文库。 三．实验意义 本实验中，全长cDNA文库的构建成功以及部分ESTs序列的获得，为GSS蛋白活性组分基因的克隆、蛋白表达和功能研究奠定了基础。 今后可以利用所构建的GSSG-cDNA文库，在大规模测序的基础上，通过EST序列分析等手段进一步开展蛇岛蝮蛇功能基因研究。蛇毒中含有多种酶类和多肽，这些物质和酶类不仅具有很强的毒理作用，而且还具有治癌、抗凝、止血、镇痛等作用，具有很高的药用和医用价值，因而引起国内外医药界的普遍重视，在临床应用中发挥着极其重要的作用，并且具有较高的经济效益,因此具有很高的开发价值，是一个值得开拓、前景广阔的领域。
作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 目的：构建大连蛇岛蝮蛇毒腺cDNA文库，在大规模测序的基础上，获得ESTs标签，为GSS蛋白活性组分基因的克隆、蛋白表达和功能研究打下基础。 基本思路:(1)构建大连蛇岛蝮蛇毒腺的cDNA文库（GSSG-cDNA)； (2)cDNA克隆测序； (3)ESTs标签的获得与分析
科学性、先进性及独特之处
- 采用SMART技术构建cDNA文库，保证了cDNA序列信息的完整性。该方法简便易行，获得全长基因的几率大，同时也可以获得低丰度表达基因。ESTs序列的获得，为进一步开展蛇岛蝮功能基因研究打下基础。而且，这是我国第一个GSSG-cDNA文库，具有首创性。能进一步发现目前人们尚不知道的基因，拓宽对蛇毒的认识，为进一步开发蛇岛蝮蛇的毒液组分的药物功能奠定了基础，应用前景广阔。
应用价值和现实意义
- 利用所构建的GSSG-cDNA文库，对GSS蛋白活性组分进行基因克隆、蛋白表达和功能研究，进而研发有效药物，应用于临床。
学术论文摘要
- 摘要：采用SMART(Switching mechanism at 5'end of RNA transcript)技术，构建了中国蛇岛蝮蛇（Gloydius shedaoensis shedaoensis, GSS）毒腺(GSSG)的cDNA(GSSG-cDNA)文库。经测定，构建的GSSG-cDNA库容量为8×10^7 cfu/mL，大多数插入片段均大于1000 bp，结果表明GSSG-cDNA文库已构建成功。对随机挑选的200个克隆进行序列测定，获得有效序列195个。通过与NCBInr蛋白质数据库进行Blast X比对分析，得到84个克隆为已知功能基因，17个克隆为未知功能基因，94个克隆为新基因，分别占有效序列的43.1%、8.7%和48.2%。该全长cDNA文库的构建成功以及部分ESTs序列的获得，为GSS蛋白活性组分基因的克隆、蛋白表达和功能研究奠定了基础。 关键词：蛇岛蝮；cDNA文库；ESTs
获奖情况
- 2011年4月获得大连医科大学第五届大学生课外学术科技作品竞赛自然科学类学术论文一等奖
鉴定结果
- 无
参考文献
- 技术：(1)SMART技术;(2)通过生物信息学Chromas和Stackpack软件获得ESTs，并通过NCBInr蛋白质数据库进行检索和序列比对。 检索目录:[1]表达序列标签（EST）在基因组学研究中的应用。生物技术通报 2004; 1:34-38. [2] 刘淑清，马驰，宗军卫，等。双向电泳结合质谱初步分析蛇岛蝮蛇毒蛋白质组。动物学杂志2009; 44(4):70-77.
同类课题研究水平概述
- 蛇毒是毒蛇腺体中分泌出来的一种毒液，含有复杂的蛋白质毒素，其成分是蛋白质或多肽类物质，还含有多种重要的酶类，这些物质和酶类不仅具有很强的毒理作用，而且还具有治癌、抗凝、止血、镇痛等作用，具有很高的药用和医用价值，因而引起国内外医药界的普遍重视，并进行了许多研究工作。 国际上，一种新型抗蛇毒血清新药在法国研制成功；日本科学家发现了蛇毒阻碍血液凝固的机制，在蛇毒中天然存在的有抗凝固作用的蛋白质，它在开发和设计新的抗血液凝固剂时有着重要的利用价值；美国科学家还发现蛇毒中的蛋白质具有抗癌作用。 目前，我国医学界和生物学界的研究课题主要有三个研究方面：一是蛇毒的化学成分和毒、药理作用的研究；二是抗蛇毒血清的研究；三是蛇毒应用的研究。随着蛇毒研究事业的蓬勃发展，我国对蛇毒研究和临床应用的进展很快，并取得了可喜的成果。例如：昆明动物研究所从浙江蝮蛇毒中提纯的磷酸二酯酶，该产品质量达到了国外同类产品的先进水平；中国医科大学蛇毒研究室从蛇岛的蝮蛇和江浙蝮蛇毒中分离出"蛇毒抗栓酶"；解放军二三八医院与沈阳药学院合作，从东北陆生的蝮蛇毒中分离出"清栓酶"制剂;贵州大学生命科学学院发现TMAC-1可通过酶切补体特定成分抑制补体活性；广东医学院附属医院证实从白眉蝮蛇蛇毒中提取出的细胞毒素H1有抑制实验性大鼠胃癌生长和转移的作用等。 蛇毒中含有多种酶类和多肽，在临床应用中发挥着极其重要的作用，并且具有较高的经济效益。因此具有很高的开发价值，是一个值得开拓、前景广阔的领域。
