基本信息
- 项目名称：
- α1,2-岩藻糖基转移酶的高效表达及其应用研究
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 本项目利用大肠杆菌高效表达系统表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori HPAG1)α1,2-岩藻糖基转移酶(fuct)基因，构建重组菌株，并与构建好的另外五株菌进行混合发酵，在体外重构人乳岩藻糖基化寡糖的代谢合成途径，实现以甘露糖为原料的人乳寡糖的规模合成，为开发新型的配方奶粉和抗黏附药物的奠定基础。
- 详细介绍：
- 本文重点通过分子生物学手段对从GDP-岩藻糖转化为岩藻糖基化寡糖代谢途径中α1,2-岩藻糖基转移酶酶基因进行了克隆，并实现了目的基因在大肠杆菌中的高效表达；并对人乳低聚糖的体外合成做了一定的研究。主要研究结果如下： (1) 采用试剂盒法提取HPAG1的总DNA，通过PCR法获得α1,2-岩藻糖基转移酶（alpha-1,2-fucosyltransferase,α-1,2-fuct）基因。得到大小为906 bp的目的基因片段，将其定向插入到原核表达载体pET-22b(+)中，得到重组表达载体pET-fuct。 (2) 将验证正确的重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，经IPTG诱导后，并用SDS-PAGE分析目的蛋白的表达情况，结果表明可表达出相对分子质量为35000，通过对目的蛋白的诱导条件进行探索，确定最佳优化优化条件为：IPTG终浓度0.1mmol/L，于25℃诱导4h，最佳诱导时刻为OD600=0.8。 (3) 对所构建的重组工程菌的酶活进行了检测，酶活达到了0.02 U/g (4) 利用 250 mL三角瓶发酵，工程菌混合发酵生成GDP-甘露糖，产量为36.36mM/L，并对产物进行了MS的鉴定，在M/Z：606.1(M-H)+有离子峰。两步混合发酵合成GDP-岩藻糖，产量达到36.36 mM/L。对产物进行谱分析（MS）显示，在M/Z：590.1(M-H)+出现离子峰。两步发酵合成岩藻糖基化寡糖。产量达到了5.12 g/L。
作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 本研究利用基因工程菌的耦合发酵中合成人乳寡糖中的α1,2-岩藻糖基化寡糖，为开发新型婴幼儿奶粉奠定基础。
科学性、先进性及独特之处
- 本项目为国内首次利用组合生物学方法实现了人乳寡糖代谢途径的重构，开创了人乳寡糖合成的新途径；利用大肠杆菌高效表达系统实现了代谢途径中各个关键酶的高效表达，最大程度的提高了各中间产物合成量，有效的提高了目的产物的产量；利用HPLC和质谱技术对产物进行分析和检测，提高了结果的准确性。
应用价值和现实意义
- 人乳寡糖具有明显的抗感染和某些重要的非特异性免疫学功能，也能促进婴儿消化道中双歧杆菌的增殖，并使梭状芽孢杆菌和肠球菌的数量大大减少，因此利用基因工程的方法，以甘露糖为原料生产人乳岩藻糖基化低聚糖，在最大程度上减少了寡糖制备的生产成本，达到规模制备的目的，为人乳寡糖及其类似物的制备提供了新策略。
学术论文摘要
- 人乳寡糖具有明显的抗感染等非特异性免疫学功能，能促进婴儿消化道中双岐杆菌的增殖，在人乳中的含量在乳糖、脂类之后，为人乳中第三大物质，人的初乳中寡糖含量为20-27 g/L，以岩藻糖基化寡糖为主，其中α1,2-岩藻糖在被检人乳中占总寡糖的比例平均为73%。本研究利用基因工程菌耦合发酵合成α1,2-岩藻糖基化寡糖，为开发新型婴幼儿奶粉奠定基础。论文首先提取H.pylori HPAG1的总DNA，通过PCR法获得906bp的α1,2-岩藻糖基转移酶基因，将其定向插入到原核表达载体pET-22b(+)中，得到表达载体pET-fuct。重组质粒经菌PCR、双酶切鉴定以及序列分析，证明pET-fuct构建成功。将正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导后，SDS-PAGE分析蛋白的表达情况，结果表明表达出相对分子质量为35000的蛋白，并确定了最佳诱导条件：IPTG终浓度0.1mmol/L,25°C培养4h，最佳诱导时刻为OD600=0.8，在最佳诱导条件下酶活达到了0.02U/g。与已经构建好的其它基因工程菌进行混合发酵，α1,2-岩藻糖基化寡糖的产量达到了5.12g/L。
获奖情况
- 无
鉴定结果
- 无
参考文献
- [1] Fanzuo Kong．Recent studies on reaction pathways and applications of sugar orthoesters in synthesis of oligosaccharides．Carbohydrate Research, 2007, 342: 345-373 [2] Koizumi，Satoshi．Large-scale production of oligosaccharides using bacterial functions [J]．Trends in Glycoscience and Glycotechnology，2003，15(82)：65-74． [3] Yazawa S，Nishimura M，Ide T，et al． Tumor-related expression of alpha1,2-fucosy- lated antigens on colorectal carcinoma cells and its suppression by cell-mediated priming using sugar acceptors for aphal1,2-fucosyhransferase[J]．Glycobiology，12(9)：545-553． [4] Sun J，Thurin HS，Cooper P，et al．Elevated ex-pression of Htype GDP-fucose：beta-D-galactoside alpha-2-L-fucosyhransferase is associated with human colon adenocarcinoma progression[J]．Proc．Nat1．Acad．Sci．1995， 92(12)： 5724-5728[5] Sambrook J，Fritsch Ef，Maniatis T．Molecular Cloning：A Laboratory Manual[M]．New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989．
同类课题研究水平概述
- 近年来，随着食品工业和生物科技的快速发展，功能寡糖的开发已成为国际生物技术领域的重要课题，寡糖产业现已成为一个应用于食品、饲料、医药、化工等行业的新兴重要产业，市场规模已达十余万吨，市场化品种已有20余种，开发品种有近百种，现仍以每年10%的速度增长，国外寡糖的年销售额近5亿美元，对功能特异的寡糖开发将具有更广阔的市场。 目前对于低聚糖的合成主要侧重于应用化学的方法，这一方法需要复杂的保护和去保护方法，不仅合成路线复杂，而且所需的糖苷供体的价格十分的昂贵，给大批量的生产低聚糖带来一定的局限性。在本项目中，将对岩藻糖基化低聚糖的合成代谢途径进行全面调控，辅以GTP过量生产的基因工程手段，以甘露糖为原料生产GDP-岩藻糖，并且与后续的岩藻糖基化转移酶共同作用合成岩藻糖基化低聚糖，在最大程度上减少了寡糖制备的生产成本，达到规模制备的目的，为GDP-岩藻糖及类似糖基供体的制备提供新策略。
