- 项目名称：
- 中药材的鉴别技术——DNA分子诊断
- 简介：
- ：随着生命科学研究的不断突破，DNA分子诊断技术鉴定中药的研究得到了极大的发展，并正逐渐成为中药鉴定的一种方法。由于DNA分子信息量高，所以DNA分子遗传标记鉴别中药材有其独到的优越性。 制成芯片固定了足够多的来自不同中药样本的特有基因序列，就可以用于多种中药样本的鉴别，使分析时间大大减少提高了鉴定效率。
- 详细介绍：
- 中药品种繁多，应用历史悠久，产区广泛。由于地理和历史的原因，药材品种混乱，如仅《中华人民共和国药典》2000年版收载的534种中药材，加之中药的同名异物或同物异名现象普遍存在以及伪品、混淆品和误用品等因素，对中药的化学成分和药理作用的研究、制剂生产、临床疗效及推广使用等都有直接影响，严重影响了中医药的信誉。同时，即使是同种药材，由于产地不同、野生和栽培以及生长年限不同表现出质量和...(查看更多)疗效上的差异，这些问题为中药材鉴别方法提出了新的挑战，依赖经典形态分类以及传统鉴别方法已无法满足鉴别的需要。随着各种先进仪器以及分子生物学的发展，各种新的鉴别方法亦纷纷推出，如红外光谱鉴别、化学指纹图谱鉴别以及DNA分子标记鉴别等，中药材鉴别领域显示出了蓬勃的生机。其中以DNA分子标记鉴别最具有发展特点。
1. DNA分子诊断的类型
1.1依据多态性的检测手段分为三类
①限制内切酶片段长度多态技术(RFLP)。
②基于多聚酶链反应(PCR)的分子标记(PAPD)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、任意引物PCR(AP-PCR)、DNA扩增产物指纹DNA(DAF)等。
③PCR-RELP技术的结合AFLP技术。
1.2根据检测DNA的多态性的方法分两类
一类直接测序DNA序列标记法，一类间接方法反映序列差异。此外，还有依据分析对象分为两类：采用检测基因组DNA多态RAPD、AP-PCR、AFLP；检测特定片段DNA的多态，即以特定的基因(或短片段的DNA)为研究对象。
2 如何运用RAPD技术
2.1 DNA的提取
DNA提取目前主要存在两种提取方法，其中CTAB法能很好去除多糖杂质。中南大学科研人员对人参、西洋参运用CTAB法提取DNA时，提高了CTAB裂解液浓度，有利于核酸与蛋白质完全裂解及CTAB-DNA复合物形成，通过增加PVP及β巯基乙醇的含量，防止植物油细胞中多酚类物质氧化成色素。在低浓度盐的条件下，CTAB-DNA复合物发生沉淀，通过离心可去除多糖类、蛋白质、色素及多酚类成
2.2准确的基因片段序列
rDNA基因被用作研究科内、属内、种内间的分子系统演化及物种鉴别的重要分子标记。rDNA在真核生物中是高度保守的，其编码区(18S，5.8S，26S)的序列具有高度的同源性，在系统上主要用于属于系统学研究，而非编码区(ITS1，ITS2)的序列常用与种间及种下等级的系统学研究。序列可变区包括matk基因编码区和trnk外显子与matk内含子之间区域。例如，中山大学生命科学院采用端终止法对杜仲分子rRNA基因(25SrRNA)5′，端基因进行测序
2.3数据分析
测序后对数据进行分析，这是判断药物近缘关系的关键一步，利用遗传分化指数(DC)值和分化指数比（PDC）值比较不同类型遗传分化度。无论从树状关系还是遗传分析的结果都能反映出不同种间的亲源关系，同时也表现出内遗传分析上相对一致性。研究人员认为通过建立RAPD分子标记数据库，并在此基础上进行样品的判断分析，这也是RAPD技术真正成为中药鉴定手段的有效途径。
3 以RAPD为基础的可重复的AFLP技术
在分子诊断技术中还有一种更新的技术，在RAPD的基础上与其他的技术相结合，得到一种重复性好、灵敏度高的DNA指纹图谱，它的具体过程是：限制内切酶片段长度多态技术(RFLP)与多聚酶链反应(PCR)技术的结合，用一个人工接头与限制酶切的基因组DNA片段进行连接，制AFLP模板DNA，合成一系列3′，末端随机改变各碱基的PCR引物进行PCR指纹图谱。目前人们成功利用AFLP法构建了人参、西洋参等基因组DNA指纹图谱。
4. DNA分子诊断在药材鉴别中的运用
随着时间的推移，RAPD等方法逐渐推出舞台。无须预先知道基因组信息的特点，使RAPD在中药材分子鉴定上成为最主要的方法，许多在RAPD基础上发展起来的方法也显示了极好的前景。目前，将得到的标准物DNA序列制作成基因芯片，通过获取不同中药样本的特异性基因序列，极大地用于中药品种的快速、准确、自动化鉴别，如果在单片芯片上固定了足够多的来自不同中药样本的特有基因序列，则此种芯片就可以用于多种中药样本的鉴别，使分析时间大大减少提高了鉴定效率
但目前对中药的特征DNA序列知之甚少，远不能满足基因序列分析鉴定中药的要求。要实现基因芯片技术鉴定中药，必须全面研究中药的基因组特征，实现药材真伪鉴别系统基因库标准基因图谱的建立。相信这项技术在不久的将来将会实现。
(收起)
