基本信息
- 项目名称：
- 碱性蛋白酶的低温改造
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 本试验采用error-prone PCR和DNA shuffling方法对嗜碱芽孢杆菌碱性蛋白酶基因apr4M进行突变，利用E.coli-Bacillus穿梭表达载体pBE2R，在大肠杆菌中建立突变文库，然后转化枯草芽孢杆菌B.subtilis WB600，构建枯草芽孢杆菌突变基因库，结合脱脂乳平板初筛、96孔板复筛获得了一株在低温下酶活性有所提高的突变子3A30。
- 详细介绍：
- 碱性蛋白酶（TC263）属于丝氨酸蛋白酶，由269个氨基酸残基组成的单链多肽，分子中没有二硫键。本试验采用error-prone PCR和DNA shuffling方法对嗜碱芽孢杆菌碱性蛋白酶基因apr4M进行突变，利用E.coli-Bacillus穿梭表达载体pBE2R，在大肠杆菌中建立突变文库，然后转化枯草芽孢杆菌B.subtilis WB600，构建枯草芽孢杆菌突变基因文库，结合脱脂乳平板初筛、96孔板复筛获得了一株在低温下酶活性有所提高的突变子3A30。该突变子所产碱性蛋白酶最适反映温度为50℃，但在20℃时的酶活力较TC263提高了30%，为8400U/mL; 该突变子产酶的热稳定性较差，在50℃保温1h残留酶活力为43%，而野生型酶的残留活力为82%。测序结果表明，该突变体中有5个氨基酸发生了替换，由于这5个氨基酸的替换，使得蛋白酶在低温下的酶活力有了提高。这为新型洗涤剂用低温碱性蛋白酶的开发奠定了基础。
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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 为解决工业生产蛋白酶在低温下的应用问题，本课题以课题组已有的高产中温碱性蛋白酶的嗜碱芽孢杆菌为研究起点，通过基因工程技术、酶技术构建出高产的低温碱性蛋白酶优良工程菌株，经过发酵优化，使其实现稳定高效表达。
科学性、先进性及独特之处
- 1．首次利用枯草芽孢杆菌表达系统进行基因突变库的构建，可直接对突变基因进行活性筛选和鉴定，降低了筛选工作量。 2.通过比较低温碱性蛋白酶与其他不同特性的碱性蛋白酶的区别，确定影响碱性蛋白酶耐低温、高酶活力、以及稳定性的关键氨基酸残基。
应用价值和现实意义
- 本作品利用error-prone PCR和DNA shuffling技术对嗜碱芽孢杆菌碱性蛋白酶基因进行低温改造，得到突变子3A30，其所产酶在20℃时的活力较野生型提高了30%，为新型洗涤剂用低温碱性蛋白酶的开发奠定了基础，响应了国家“节能减排、绿色环保、以及可持续发展”的号召，创建“酶”好家园。
学术论文摘要
- 碱性蛋白酶是目前市场上流行的洗涤添加剂，能大幅度提高洗涤去污能力，特别是对汗渍、奶渍、油渍等蛋白类污垢,具有独特的洗涤效果。其主要成分为枯草杆菌蛋白酶，属中温酶，通常在40-60℃具有最佳的酶活力，不适于目前低碳、环保、节能的发展趋势。本试验采用error-prone PCR和DNA shuffling方法对嗜碱芽孢杆菌碱性蛋白酶基因apr4M进行突变，利用E.coli-Bacillus穿梭表达载体pBE2R，在大肠杆菌中建立突变文库，然后转化枯草芽孢杆菌B.subtilis WB600，构建枯草芽孢杆菌突变基因文库，结合脱脂乳平板初筛、96孔板复筛获得了一株在低温下酶活性有所提高的突变子3A30。该突变子所产碱性蛋白酶最适反映温度为50℃，但在20℃时的酶活力较野生型菌株提高了30%，为8400U/mL; 该突变子产酶的热稳定性较差，在50℃保温1h残留酶活力为43%，而野生型酶的残留活力为82%。这为新型洗涤剂用低温碱性蛋白酶的开发奠定了基础。
获奖情况
- 无
鉴定结果
- 无
参考文献
- [1] Samad Jahandideh，Parviz Abdolmaleki，Mina Janandideh，Ebrahim Barzegari Asadabadi．Sequence and structural parameters enhancing adaptation of proteins to low temperatures[J]．Journal of Theoretical Biology，2007，246（1）：159-166． [2] Runying Zeng，Rui Zhang，Jing Zhao，Nianwei Lin．Cold-active serine alkaline protease from the psychrophilic bacterium Pseudomonas strain DY-A：enzyme purification and characterization[J]．Extremophiles，2003，7(4)：335-337． [3] Tang X M, Shen W, Lakay F M, Shao W L, Wang Z X, Prior B A,Zhuge J. Cloning and over-expression of an alkaline protease from Bacillus licheniformis.Biotechnol Lett, 2004，26(12): 975-979． [4] Sandy Primrose, Richard Twyman, Bob Old. Principles of Gene Manipulation[M]. Higher Education Press. 150-158. [5] Frances H Arnold，Patrick L Wintrode，Kentaro Miyazaki，Anne Gershenson．How enzymes adapt：lessons from directed evolution[J]．Trends in Biochemical Sciences，2001，26(2)：100-106．
同类课题研究水平概述
- 由于低温碱性蛋白酶的广泛应用和对工业以及人们生活带来的巨大社会效益和经济效益，我国政府早在“七五”和“八五”期间就开始组织专家进行碱性蛋白酶产生菌的筛选和发酵研究，中科院微生物研究所邱秀宝等人曾从适冷性海洋微生物中筛选到210株产蛋白酶的菌株，并发现一株产低温碱性蛋白酶活力较高的海洋细菌，经过UV诱变后获得一突变株N1-35，经发酵后，其发酵液在20℃下酶活提高到100U/ml左右，但当温度升高到40℃以上10min后，酶活迅速下降。“九五”和“十五”期间，山东大学微生物技术国家重点实验室陈秀兰等人，从渤海湾海水中筛选得到了一株20℃下产碱性蛋白酶为320U/ml的低温菌株，但该菌株所产蛋白酶在50℃下保温20min后，酶活就丧失75%以上（海洋生物863资助项目）。另外，中国水产科学研究院的孙谧等人，在完成863项目“海洋碱性蛋白酶和溶菌酶的研究与开发”的过程中，通过复合诱变原生质体的方法获得了一株低温碱性蛋白酶高产菌，该菌20℃下发酵液的酶活达到了4000U/ml，但是仍然不能满足产业化的要求。这些直接分离纯化得到的低温碱性蛋白酶大多来源于嗜低温菌和耐低温菌，如假单胞菌属、芽孢杆菌属、黄杆菌属、异单胞菌属等，这些菌的最适生长温度和产酶温度一般都较低，约在10～20℃范围内，所产碱性蛋白酶此温度下也具有相对较高的酶活；但它们同时也存在一个致命的缺陷，即对温度极度敏感，热稳定性差[2]，这大大限制了它们的加工特性和应用，尤其是在纺织印染、制革和洗涤剂行业中的应用。 国外的研究除进行低温碱性蛋白酶产生菌的发现外，还着重于对中温碱性蛋白酶的耐低温特性的改造上，其中最引人注目的是Giulio等人对大量适冷酶结构统计分析得出的结论，即把中高温碱性蛋白酶的α螺旋外侧Glu突变成Ala，是中高温蛋白酶人工定向进化低温碱性蛋白酶首先考虑的关键点。
