基本信息
- 项目名称：
- 小鼠N-乙酰氨基葡萄糖转移酶IVa基因RNA干扰载体的构建
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 本作品利用载体介导RNAi，实现RNA干扰在哺乳动物体内长期稳定发挥作用。同时选取的靶基因Mgat4a与肿瘤转移机制目前研究较少，具有创新性。
- 详细介绍：
- 本研究采用pLL3.7干扰质粒表达载体, 插入oligo DNA后能在靶细胞中持续转录生成shRNA, 从而生成具有干扰作用的siRNA。同时该质粒含有GFP基因, 用于检测表达载体的转染情况。我们利用公用网站按照RNAi 序列设计原则, 设计合成3对含干扰序列的oligo DNA片段, 克隆入干扰质粒表达载体pLL3.7, 构建了能表达siRNA 的重组干扰质粒。通过酶切和测序鉴定, 证实成功构建pLL3.7/shRNA1、2、3表达质粒。并成功转染293T细胞后, 检测到GFP的阳性表达。为后续研究GnT-IVa基因在糖蛋白N-聚糖分支合成中的作用，及肝癌的淋巴道转移机制奠定了实验基础。
作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 目的：针对小鼠N-乙酰氨基葡萄糖转移酶IVa的基因构建RNA干扰表达载体，为研究其功能提供有力工具。 基本思路：针对小鼠N-乙酰氨基葡萄糖转移酶IVa的基因设计多对shRAN序列，利用分子克隆技术，插入表达载体pLL3.7，鉴定正确的重组载体后，检测载体介导的下调靶基因的功能，可以为后续研究GnT-IVa基因在糖蛋白N-聚糖分支合成中的作用，及肝癌的淋巴道转移机制奠定了实验基础。
科学性、先进性及独特之处
- 1、N-乙酰氨基葡萄糖转移酶（GnT）是催化N聚糖链分支合成的关键酶，GnTs成员之一的GnT-IVa与肿瘤转移的关系不清楚，研究较少。 2、载体介导的RNAi能够实现针对靶基因的稳定下调，为研究靶基因的功能提供有力支持。
应用价值和现实意义
- 1、RNA干扰载体能够使载体携带的shRNA片段整合到靶细胞的基因组中, 持续地发挥对目的基因的沉默效应, 使长期稳定下调哺乳动物细胞内的目的基因成为可能。 2、本研究构建了针对GnT-IVa 基因的RNAi表达载体，为研究GnT-IVa在小鼠肝癌细胞淋巴道转移中的作用机制奠定了基础。
学术论文摘要
- 为了构建针对小鼠N-乙酰氨基葡萄糖转移酶（GnT）IVa基因的RNA干扰( RNAi)表达载体。本研究针对GnT-IVa基因序列设计合成 3对shRNA序列，经退火成双链后，与酶切后的线性表达载体pLL3.7连接，然后转化大肠杆菌，经筛选后扩大培养。经酶切和测序鉴定构建的干扰表达载体，并转染293T细胞，应用倒置荧光显微镜检测干扰表达载体中绿色荧光蛋白（GFP）的表达。经酶切及测序证实shRNA序列插入到干扰表达质粒中，并检测到干扰表达载体中GFP的表达。说明成功构建了针对小鼠N-乙酰氨基葡萄糖转移酶（GnT）IVa基因的干扰表达载体。
获奖情况
- 2011年4月 该作品获得大连医科大学第五届大学生课外学术科技作品竞赛 特等奖
鉴定结果
- 无
参考文献
- RNA干扰（RANi） Fire A,et.al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature,1998,391(6669)
同类课题研究水平概述
- 1、N-乙酰氨基葡萄糖转移酶（GnT）是催化N聚糖链分支合成的关键酶，研究发现GnT-V的表达促进肿瘤转移，而GnT-III的表达抑制肿瘤转移。其GnTs成员之一的GnT-IVa催化β1，4分支三天线N-聚糖的合成，其与糖尿病的关系近几年有所报道，但其与肿瘤转移的关系不清楚。目前国内外研究较少。 2、RNA干扰现象是一种特异性转录后的基因沉默现象，因其具有快速、有效、易操作、特异性强等优点, 现已被广泛应用于基因功能分析、信号转导通路和基因治疗的研究，但是目前国内多用采用直接化学合成siRNA片段的方法直接将干扰片段转染进入目的细胞，因此RNAi 片段转染进入目的细胞以及siRNA(Dicer酶切或化学合成)作用的短暂性，在目前的哺乳动物RNA干扰技术的应用中受到限制。载体介导的RNAi 系统则可通过RNA 多聚酶Ⅲ启动转录产生shRNA 实现RNAi。此方法国内应用较少，且尚待改进和提高。
