基本信息
- 项目名称：
- 利用mimic和inhibitor library高通量筛选与脂肪沉积与肌肉肥大相关的关键miRNA
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 通过瞬时转染过表达和抑制miRNA，建立miRNA功能的研究体系。
- 详细介绍：
- miRNA是近年来研究最热的一类对各种生物学功能起调控作用的小RNA，实验在前期已构建在猪脂肪和肌肉组织中特异表达的miRNA文库。本研究选取在鼠和人中对调节脂肪细胞脂质代谢(miR-27a、miR-143) 和肌肉细胞肥大萎缩 (miR-1、miR-206) 有明显功能的miRNAs进行功能验证，实验通过将mimic、inhibitor瞬时转染进猪成熟脂肪和肌肉细胞，测定转染后脂肪和肌肉细胞的表型指标用以反映其生物学调控功能。脂肪细胞的表型包括：甘油三酯 (TG) ，甘油 (GLY) ，游离脂肪酸 (FFA) 及总蛋白的检测 (BCA) ；肌肉细胞的表型指标用肌管直径表示。以此建立猪脂肪、肌肉细胞的miRNA功能研究体系。
作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 通过建立猪前脂肪细胞和成肌细胞的培养、诱导、转染体系，完成诱导后成熟脂肪和肌肉细胞的miRNA mimic与inhibitor转染，检测两种细胞的表型指标，分析过表达和低表达miRNA后对脂肪细胞脂质代谢和肌肉细胞肥大萎缩的影响，以此筛选与猪脂肪沉积和肌肉肥大相关的关键miRNA。
科学性、先进性及独特之处
- miRNA是一类重要的非编码小分子RNA，在物种间具有高度的保守性，通过与mRNA的3＇UTR结合，调控基因的转录表达。本实验在前期通过Solexa深度测序建立了microRNAome的前提下，拟采用细胞转染技术对太湖猪肌肉和脂肪细胞中miRNA进行过表达与抑制，检测细胞变化各项相关指标，以期找到在脂肪沉积与肌肉肥大过程中起重要调控功能的miRNAs，为后续活体内的研究奠定基础。
应用价值和现实意义
- 1、建立一套猪脂肪、肌肉细胞的培养，诱导，转染体系； 2、建立一套脂肪和肌肉细胞中miRNA的功能研究方法，为接下来进行的miRNA 文库高通量筛选奠定基础。
学术论文摘要
- 摘要：MicroRNA (miRNA) 是一类约20～25nt的小分子核苷酸，在细胞内调控多种生物学功能。本研究选取在鼠和人中对调节脂肪细胞脂质代谢(miR-27a、miR-143) 和肌肉细胞肥大萎缩 (miR-1、miR-206) 有明显功能的miRNAs进行功能验证，实验通过将mimic、inhibitor瞬时转染进猪成熟脂肪和肌肉细胞，测定转染后脂肪和肌肉细胞的表型指标用以反映其生物学调控功能。脂肪细胞的表型包括：甘油三酯 (TG) ，甘油 (GLY) ，游离脂肪酸 (FFA) 及总蛋白的检测 (BCA) ；肌肉细胞的表型指标用肌管直径表示。结果表明： miR-27a能够抑制脂肪沉积，而miR-143促进了脂肪沉积。转染miR-1和miR-206组与negative control组相比，肌管直径都没有显著差异。通过此研究方案建立起了一套猪脂肪、肌肉细胞miRNA功能研究体系，为下一步miRNA的文库筛选做好铺垫工作。
获奖情况
- 无
鉴定结果
- 无
参考文献
- [1] Lynn FC. Meta-regulation: microRNA regulation of glucose and lipid metabolism[J]. Trends in Endocrinology & Metabolism. 2009, 20(9): 452-459. [2] Li M, Xia Y, Gu Y et al. MicroRNAome of Porcine Pre-and Postnatal Development[J]. PloS one. 2010, 5(7): e11541. [3] Small EM, Frost RJA, Olson EN. MicroRNAs Add a New Dimension to Cardiovascular Disease[J]. 2010. [4] Chen JF, Mandel EM, Thomson JM et al. The role of microRNA-1 and microRNA-133 in skeletal muscle proliferation and differentiation[J]. NATURE GENETICS. 2005, 38(2): 228-233. [5] Xu P, Vernooy SY, Guo M et al. The Drosophila MicroRNA Mir-14 Suppresses Cell Death and Is Required for Normal Fat Metabolism[J]. 2003, 13: 790-795. [6] 李虹仪, 张永亮, 习欠云, 等. 猪miRNA 的研究进展[J]. 中国畜牧兽医. 2010. [7] Lam LT, Lu X, Zhang H et al. A microRNA screen to identify modulators of sensitivity to BCL2 inhibitor ABT-263 (Navitoclax)[J]. Molecular Cancer Therapeutics. 2010.
同类课题研究水平概述
- microRNA (miRNA) 作为一类长度约为22nt的非编码小RNA，已被大量实验证实是一种重要的基因转录表达调控因子。miRNA通过种子序列与mRNA的3＇UTR区域部分或完全匹配抑制mRNA翻译或引起mRNA降解来实现其对基因表达的调控。然而，相比于人microRNAome，猪的miRNA研究严重滞后。在Sanger miRBase 16.0版中 ( ，猪目前公布的miRNA数据是228条，与人的1424条及鼠720条相比，猪作为基因组与人大小接近的物种，其miRNA数量将远远超过目前公布的数据。本实验室在前期的研究中，通过Solexa深度测序技术分别对从胚胎到成年共计10个发育阶段的样品进行miRNA序列的深度测定，目前pre-miRNA序列已经增至867条，编码的成熟体miRNA序列增至1004条，其中特异miRNA序列达到777条。 近年来的研究结果发现miRNA与肌肉的生长发育关系密切。miR-1会促进心肌细胞肥大，从而抑制肌肉细胞的增殖。miR-206和miR-133共同作用，抑制肌原细胞融合。miR-1与miR-133位于同一条染色体上，但却有着不同的调节功能。miR-1促进成肌细胞分化成成熟的肌肉细胞，但却抑制它们的增殖。而miR-133则加快成肌细胞的增殖速度，同时也抑制它们的分化。在脂肪分化细胞及脂质代谢中， miR-14通过改变三酰基甘油与二酰基甘油之间的水平调节脂肪代谢。抑制正常小鼠miR-122的表达能减少血浆胆固醇水平，增加肝脏脂肪酸代谢，且降低肝脏脂肪酸及胆固醇的合成速率。作为人类最理想的生理模型，猪miRNA的功能研究都可为人类的miRNA功能研究提供参考数据，甚至可作为人类miRNA功能验证的模型。而猪前脂肪细胞和成肌细胞的培养体系建立较为完善，可为miRNA功能的体外研究提供稳定的细胞平台。 miRNA的功能研究与基因相似，主要通过过表达 (mimic) 或者抑制 (inhibitor) miRNA的表达验证其对细胞表型的影响。而mimic和inhibitor library的高通量筛选可以同时对几百到几千个miRNA进行功能的初步筛选，但其应用目前也仅限于在人类的研究中。
