基本信息
- 项目名称：
- 寡糖类疫苗合成方法学探究
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 我们希望探究出一种比较好的合成寡糖类疫苗方法。 首先将固相有机合成和化学酶法合成有机的结合起来，以大量的制备细胞表面糖苷用于糖生物学基础研究和药物研发。基于酶法合成的不足，我们设想通过可反复使用的连接臂将寡糖的还原端固定在树脂上，使用非天然底物引入特殊基团，先进行酶法糖链延伸，再通过化学修饰合成特殊结构的寡糖的策略。 之后，我们还设计了策略2-固相萃取法进行合成。
- 详细介绍：
- 第一代线性高分子载体的合成： 考虑到线性高分子要具有水溶性我们悬着丙烯酰胺，烯丙胺（10:1）为单体在过硫酸钾60℃下聚合6h，得到白色固体树脂1。具有极强的水溶性，但通过1H NMR分析烯丙胺比例非常少，为丙烯酰胺均聚产物，且不溶于DMF。以上这些缺点限制了我们对改高分子的进一步修饰。 第二代线性高分子载体的合成 基于前一代高分子的失败经验，我们将极性较强的丙烯酰胺替换极性相对较小的N-异丙基丙烯酰胺，希望提高产物树脂2在DMF中的水溶性。在DMF下，以AIBN为引发剂，60℃下聚合24h。反应完成后透析除去DMF和引发剂等杂质，冻干。得白色絮状固体。产物水溶性和在DMF中的溶解性均很好。但通过1H NMR分析丙烯胺比例非常少，为N-异丙基丙烯酰胺均聚产物。该产物同样不能进行进一步修饰。 第三代线性高分子载体的合成 基于前二代高分子的失败经验，我们将烯丙胺替换为N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯，在DMF下，以AIBN为引发剂，60℃下聚合24h。反应完后逐滴加入20eq乙二胺，室温搅拌24h，反应完成后透析除去DMF和引发剂等杂质，冻干。得白色絮状树脂3。产物水溶性和在DMF中的溶解性均很好。但通过1H NMR分析NH2比例与我们设计的相同。以下是所得到的高分子的氢谱，通过粘度计测定所得分子量范围5KDa-10KDa。取代度20% 在Ar气保护下，向150mg（1.2eq） NaH中加入18ml无水THF，和1ml 2-(Diethoxyphosphoryl)propionic acid ethyl ester（1eq），搅拌30min，加入α-Ketoglutaric acid diethyl ester（600mg， 3mmol），室温搅拌1h后，TLC检测反应完全。加入10mlNH4Cl饱和溶液，以乙醚（20ml×3）萃取，合并有机相以无水硫酸镁干燥，以石油醚：乙酸乙酯=10:1柱层析，得无色油状物785mg，产率91%。 760mg 3-Pentene-1,3,4-tricarboxylic acid, 1,3,4-triethyl ester溶于22ml无水乙醇，6.5ml 2M KOH水溶液中，回流1h，加入20ml 水，冷却至室温，旋转蒸发至没有有机溶剂蒸出，以二氯甲烷洗涤水相（10ml×3），冰浴下以浓盐酸调节pH值至2，搅拌20min，以乙酸乙酯萃取（20ml×3）萃取，合并有机相，干燥后旋蒸。 将酸性敏感链交联到线性树脂上 将160mg 3-Pentene-1,3,4-tricarboxylic acid, cyclic 3,4-anhydride、76μL草酰氯溶于12ml无水THF中，室温搅拌2h。将反应液旋干，溶于3ml无水DMF中，将150mg制备得到的树脂3和122μL三乙胺溶于6ml无水DMF，将酰氯的DMF溶液逐滴滴入含有树脂的溶液中室温搅拌24h后，加入9ml水，以1M HCl调节pH值至2，室温搅拌30min，以30%的乙醇透析，将透析液旋干得白色固体树脂4，取代度15%。可以明显看到树脂中酸酐的吸收信号1765.01，1715cm-1 全乙酰化2-溴乙基β乳糖苷的制备 将6.36g 4-O-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl), 2,3,6-triacetate-β-D-Galactopyranose溶于40ml二氯甲烷和三氯乙腈（5.68g，40mmol，4eq）。在-5 ºC下逐滴加入DBU（0.42g,3mmol,0.1eq），室温搅拌1小时，TLC检测反应完全，溶液旋干后，经柱层析（二氯甲烷：乙酸乙酯=20:1），得白色固体7g。将所得三氯亚胺酯供体和2-溴乙醇溶于40ml无水二氯甲烷中，在Ar气保护下，-10ºC加入TMSOTf（(0.1M, 0.13 mL, 0.02eq)的二氯甲烷溶液，室温搅拌30min，TLC检测反应完全，反应以三乙胺猝灭，旋干，经柱层析（石油醚：乙酸乙酯=2:1）得到白色全乙酰化2-溴乙基β乳糖苷4.83g，两部收率65% 全乙酰化2-叠氮乙基β乳糖苷的制备 将1.6g 2-溴乙基β乳糖苷溶于21ml无水DMF，加入1.4g叠氮钠（21.6mmol，10eq），25ºC下搅拌24h，TLC检测反应完全，将反应液倒入冰水中，以二氯甲烷（40ml×3）萃取，干燥，旋干后得到全乙酰化2-叠氮乙基β乳糖苷白色固体1.4g，产率95%。 2-叠氮乙基β乳糖苷的制备 将1.4g 全乙酰化2-叠氮乙基β乳糖苷溶于20ml无水MeOH，以甲醇钠调节pH值至8，25ºC下搅拌30min，TLC检测反应完全，以Dowex 50WX2调节pH值至7，过滤，旋干后得到2-叠氮乙基β乳糖苷白色固体690mg，产率85%。 将乳糖联到树脂上 2-叠氮乙基β乳糖苷690mg溶于10mlMeOH，加入50mg10%Pd/C，4atm下反应30min。滤除Pd/C将反应液旋干，加1ml水冻干，得白色絮状固体600mg。取出100mg与330mg树脂4溶于40ml无水DMF，加入200μL三乙胺，25ºC下搅拌12h。以水透析得到，冻干得到白色絮状固体树脂5。经1HNMR鉴定取代度约12%。树脂具有水溶性。 一锅多酶合成Siaα2-6Lac三糖 取树脂4 60mg，加入NmCSS（1mg\ml）120μL，Pd Sia2,6T（1mg\ml）240μL,Tris-HCl（1M，pH=8.0）312μL，2.5mL双蒸水，MgCl2（4.8mg，终浓度10mmol），CTP 25mg(1.5eq),唾液酸15mg，混合均匀。25ºC下100rpm下，反应12h。将反应液煮沸5min，透析后，透析袋冰浴下以PB-10pH计检测溶液pH值，以1M HCl调节pH值至3.5，25ºC下100rpm下，反应12h。将反应液以12000rpm离心，上清以P2柱分离，得目标化合物60mg，产率35%。
作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 我们拟将固相有机合成和化学酶法合成有机的结合起来，大量制备细胞表面糖苷用于糖生物学基础研究和药物研发。基于酶法合成缺点，我们设想通过可反复使用的连接臂将寡糖的还原端固定在树脂上，使用非天然底物引入特殊基团，先进行酶法糖链延伸，再通过化学修饰合成特殊结构的寡糖的策略。 我组成功通过酶法合成Globo—H，我们考虑通过固相合成的策略简化分离纯化步骤，提高产率。
科学性、先进性及独特之处
- 策略1将固相有机合成和化学酶法合成有机的结合起来，具有如下优点： 1）我们可以通过超滤或透析等简单手段，去除反应过程中产生的UDP，未反应的供体的底物。然后，重新加入新的底物，推动反应接近完全。 2）如果某些步骤不适合固相反应，由于连接臂可以反复使用，我们可以使用“take-off”的策略，不会影响后续固相合成 3）可以在酶法合成完成后，通过化学修饰得到特殊的结构。
应用价值和现实意义
- 本课题致力于开发的基于固相的化学酶法合成方法及其固相萃取法，将有效的推动糖化学，糖生物学及寡糖类药物的研发，具有极高的理论价值。合成得到的寡糖类抗原及其糖蛋白复合物，很有潜力成为新一代的疫苗，从而产生巨大的经济效益。
学术论文摘要
- 建立一个基于对pH值敏感的水溶性聚合物的多糖的酶催化合成的总体战略。在中性条件下，聚合物具有水溶性，并且利于酶催化反应的进行。而在酸性条件（pH值低于4.0），产品从聚合物中脱离，显示出不溶解性，可以很容易地从反应体系中分离出来。6-Sialyl LN的类似物就可以通过这种方法合成。
获奖情况
- 南开大学本科生创新科研优秀项目三等奖
鉴定结果
- 无
参考文献
- Cancer Vaccine Globo-H carbohydrate antigens Solid phase Chemical Enzymatic Strategy Solid phase extraction technology
同类课题研究水平概述
- 近年来的研究表明，细胞表面的糖抗原的表达量通常在细胞癌化过程中大大增加，而且某些特定的寡聚糖只在某些特定的癌细胞上表达。例如，Globo—H通常在卵巢癌、胰腺癌，前列腺癌，乳腺癌和直肠癌中过量表达。因此寡糖抗原成为一种潜在的肿瘤疫苗分子。目前，以寡糖分子为基础的一系列衍生物已进入临床试验阶段。结果表明这种疫苗在绝大多数的病人体内产生免疫反应，并且没有自免疫的副作用产生。 单糖结构的化学修饰可以增加多糖疫苗的免疫原性。化学修饰的带有非自然的N-acyl的侧链的sialic aid残基，与相应的自然的sialic aid疫苗相比具有更强的免疫原性。Globo—H与KLH的复合物已进行了临产前的试验，正在进行临床试验。临产前的试验结果表明，该糖蛋白复合物可有效的刺激人免疫系统产生抗体 发展寡糖类疫苗存在这三个技术瓶颈： 1）发展寡糖类疫苗的技术瓶颈之一：稀有单糖糖库的构建 寡糖抗原往往含有稀有的单糖，现有的单糖合成策略主要有两条：“糖到糖”和“非糖到糖”。就合成设计而言，构建糖库比合成单一个体更具有挑战性。对于构建糖库，好的合成设计往往需要有“收束性”（convergent design），即合成是从数目较少的关键中间体出发，经过较短的路线来完成。目前为止，用于构建糖库的收束性设计凤毛麟角。 2) 发展寡糖类疫苗的技术瓶颈之二：寡糖合成（酶法的应用） 在生物大分子中，多肽和寡核苷酸的合成技术已经十分成熟，自动化的合成已经实现商业应用；相比之下，寡糖合成技术的发展却大大滞后。主要原因是由于寡糖链的立体化学更为复杂；直链或支链、呋喃环间的多种连接方式以及糖苷链的α/β构型等等因素。 寡糖的合成有化学和生物酶法合成两种，他们相互优劣，互为补充。酶法多用于合成某一特定的（天然）寡糖，如α-Gal，ABO血型抗原，志贺毒素(Shiga toxin)的受体Gb3等；化学法则更适合于（天然）寡糖的衍生化。 3) 发展寡糖类疫苗的技术瓶颈之三：刺激免疫的载体的选择 寡糖类抗原是较弱的抗原，需要选择合适的抗原才能刺激免疫反应，现在选用的有BSA，KLH,TT,DT等。
