基本信息
- 项目名称：
- 葡萄生产废弃叶片中白藜芦醇的诱导及诱导机制研究
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 科技发明制作A类
- 简介：
- 本作品通过诱导葡萄叶片氧应激反应升高其药用活性成分白藜芦醇并研究了相应机制，筛选出了高诱导率的诱导剂，并寻找合适的提取分离方法。为从葡萄生产废弃废弃叶中获取高价值药物提供了合理的解决方案。
- 详细介绍：
- 一 研究背景 白藜芦醇是作为一种重要的植保素而被发现并得以深入研究。白藜芦醇有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗自由基、肝脏保护、神经保护、心血管保护、免疫调节等药理作用。白藜芦醇的诱导剂有UV、CO2、病原菌、臭氧、氯化铝、乙磷铝、水杨酸等。针对现有白藜芦醇获取材料、方法及诱导方式的不足，我们进行了有针对性的研究。 二 主要研究内容 （1）诱导剂对葡萄叶片中白藜芦醇诱导与氧应激关系的研究。 （2）叶片白藜芦醇合成途径相关限速酶表达差异分析。 （3）叶片中白藜芦醇提取方法的研究。 三 研究的目的及意义 白藜芦醇有抗肿瘤 、抗炎、抗氧化、抗自由基、肝脏保护、神经保护、心血管保护、免疫调节、拮抗庆大霉素耳毒性、抗病毒、辐射防护等作用。随着对白藜芦醇研究的不断深入，发现白藜芦醇还具有抗爱滋病的作用。最引人注目的是其抗氧化和清除自由基的作用,这涉及到与人体健康密切相关的许多生理疾病如动脉粥样硬化，凝血过程，炎症与过敏反应，肿瘤与癌变等，由于白黎芦醇对人体这些指标具有重要调节作用，而被认为是最有希望的天然化学防癌剂之一。 白藜芦醇是作为一种重要的植物抗毒素（植保素）而被发现并得以深入研究，它在植物体内的合成、积累和变化都同植物抗逆、抗病性有着直接的联系，是植物系统获得性抗性的主要指标之一。葡萄叶片在缺少诱导因素的情况下，白藜芦醇含量很低，但在受到非生物胁迫时，白藜芦醇等次生代谢物质的合成会急剧增加。白藜芦醇的诱导剂有UV、CO2、病原菌、臭氧、氯化铝、乙磷铝、水杨酸等。目前已有许多针对白藜芦醇合成诱导及其机制的研究，从这些诱导及其机制中发现其机理有可能是通过上调叶片内的氧化状态而诱导白藜芦醇积累，遗憾的是，相关证据不足，难以作出正确的判断。 白藜芦醇现可从植物虎杖的根茎提取、分离、纯化而得。但是，目前虎杖的主要来源于有限野生资源，长期采挖势必将造成野生资源过度短缺，植被和生态环境遭到破坏。目前尚无虎杖规范化栽培，加之国家实行中药材GAP 管理 ，因此需要从其它一些优势植物资源中去提取。葡萄中也含有茋类物质白藜芦醇，葡萄皮、籽中富含白藜芦醇，是具有重要开发价值的潜在天然产物。新疆葡萄产业极为丰富，每年秋季丢弃的叶子多达几百万吨，目前国内对葡萄叶开发利用尚不多，若将其作为另一种白藜芦醇的提取新来源，便可以变废为宝。然而葡萄中白藜芦醇含量过低，不易提取。藉此，我们期待采用生物技术等方法进行诱导，提高白藜芦醇的含量，并摸索出一种便于提取的方法。该作品的实施可充分利用地方农业生产废弃物进行药物开发、具有潜在的社会效益和经济效益。 本研究在前期研究基础上，通过不同的诱导剂及组合，直接或间接测定其对农业生产废弃葡萄叶片中白藜芦醇积累的影响及相关机制，为葡萄废弃叶片的开发利用提供依据。 四 结果及讨论 我们的前期工作发现：通过所筛选诱导剂处理葡萄叶片后，会引起白藜芦醇物质的快速积累，苯丙氨酸生物代谢途径发生开启；发现葡萄叶片过氧化物酶活性显著提高，同时叶片内源过氧化氢含量迅速升高。这说明，白藜芦醇的积累可能是一种氧化胁迫直接或间接的结果。通过限定氧化剂处理葡萄叶片，并观察其对叶片的氧应激作用与白藜芦醇积累的关系时发现，氧化型诱导剂诱导白藜芦醇积累呈现显著的时效与量效关系，这初步证实了我们的猜测。为了进一步确认氧化型诱导剂对白藜芦醇积累的调控作用，我们分析了白藜芦醇合成途径相关所有限速酶的表达情况，结果发现氧化型诱导剂对茋类物质合成途径相关酶基因表达有明显上调作用。结合以前工作基础其它部分内容，我们认为葡萄白藜芦醇积累依赖于细胞内氧化还原态某种程度的失衡。藉此，我们建立了一种可以调控葡萄叶片氧化还原态改变的方法及技术方案，并成功筛选了部分诱导剂，对葡萄生产废弃叶片白藜芦醇诱导效果显著。 新疆是我国第一大葡萄产区，2009年葡萄种植面积达到150万亩。预计到2011年葡萄总种植面积达到200万亩。石河子、玛纳斯、昌吉、阜康产区位于北疆天山北麓与准噶尔盆地南缘库尔班通古特沙漠之间形成的山前冲积扇平原，是重要的酿酒葡萄产区。通过研究葡萄生产废弃叶片白藜芦醇的诱导及诱导机制，可以在理论上深入探讨氧应激反应与植物防卫系统互作关系，增加氧应激与植物抗氧化次生代谢方面关系的直接证据。值得一提的是，诱导葡萄白藜芦醇的积累是与葡萄的抗病性紧密联系的，这样在诱导葡萄白藜芦醇产生同时，能提高受试葡萄对病原的抗性，对研究葡萄的病害防治有着重要理论指导价值。另外，葡萄种植过程中，每亩地可产生数吨的废弃叶片，价格低廉，可以作为一种潜在的药用资源进行开发。本研究的现实意义在于可以为新疆的葡萄产业提供一种变废为宝的方法。
作品专业信息
设计、发明的目的和基本思路、创新点、技术关键和主要技术指标
- 1、作品设计思路： 2009年新疆维吾尔自治区葡萄种植面积就高达150万亩。为了保证果实的质量，葡萄种植期间需要多次除去植株外周叶片。以1983年Maurice Gallay推荐的采摘前期除叶方式计算，1/3的葡萄叶片会被除去，加上葡萄采摘后田间管理需要打叶压藤越冬等操作，这样每亩地可产生数吨的废弃叶片。本作品拟利用白藜芦醇代谢受葡萄抗病防卫系统控制这一规律，通过模拟激发子诱导反应研究此过程中葡萄叶药用活性成分白藜芦醇的积累规律，筛选高诱导率的诱导剂；研究诱导剂量、诱导方式及与叶片处理方式对葡萄叶片中白藜芦醇含量的影响并寻找合适的提取分离方法。 2、发明目的： 为将葡萄生产废弃物作为白藜芦醇提取原料寻找合适的诱导剂及研究相应诱导机制，指导葡萄叶白藜芦醇的获取。 3、创新点与技术关键： ①通过模拟病原氧应激方式诱导葡萄离体叶片超量积累植保素—白藜芦醇（本作品关键技术）。 ②利用葡萄废弃叶片替代虎杖等原料提取高价值原料药白藜芦醇。 4、主要技术经济指标： ①筛选出诱导率高的激发子（使受试叶片白藜芦醇含量升高5倍以上）。 ②掌握一套能够稳定诱导叶片白藜芦醇含量升高并进行提取的小试实验方法。 ③相关研究内容申请发明专利1-2项。
科学性、先进性
- 本作品科学先进性在于以下： ①有益特征在于所使用方法能够稳定的诱导在体及离体葡萄叶片、葡萄茎干及果实中白藜芦醇含量升高。诱导效果不会由于白藜芦醇提取前不可避免的光照，虫害，采摘，温度等生物及环境因素变化而发生明显下降，保障了葡萄材料诱导白藜芦醇含量的稳定性。 ②本项目技术的有益效果在于所使用诱导方法操作简单、安全。本作品技术仅涉及单一诱导物，仅涉及喷洒一个操作环节，无论是液态诱导剂还是干粉诱导剂均便于进行喷洒操作，喷洒后不用洗脱，诱导剂操作喷洒过程不会对操作人员造成人身毒害。
获奖情况及鉴定结果
- 该作品已于2010年10月19日以会议形式进行鉴定，鉴定结论：专家组一致认为研究成果达到了国内领先水平。 成果鉴定登记号：鉴字校[2010]04 批准日期2010.12.10
作品所处阶段
- 实验室阶段
技术转让方式
- 专利权转让或专利实施许可
作品可展示的形式
- 实物、产品、图片、样品
使用说明,技术特点和优势,适应范围,推广前景的技术性说明,市场分析,经济效益预测
- 本作品的创造性在于首次发现离体叶片诱导的规律和最佳诱导剂。本作品的先进性在于研究了葡萄叶白藜芦醇的诱导规律及积累机制；研究了诱导剂量、诱导方式及与叶片处理方式对葡萄叶片中白藜芦醇含量的影响，为将葡萄叶作为白藜芦醇提取原料提供合理的处理方案。本作品适合推广应用于葡萄种植及加工等农业领域，也适合推广生物技术制药领域；新疆是葡萄种植大省，2009年新疆葡萄种植面积就高达150万亩。本作品前景在于利用这一有利条件和资源基础进行实施，提供一种增加葡萄品质、提高葡萄营养保健价值及葡萄生产相关副产品综合利用的方法，可以缓解白藜芦醇需求增加与生产原料虎杖资源日益紧张的矛盾。
同类课题研究水平概述
- 白藜芦醇存在于一些药用植物和食用植物中。在白藜芦醇获取途径方面，选择合适的植物材料成为该领域热点问题。目前市售白藜芦醇的来源主要是从蓼科植物虎杖根茎中提取。譬如公开号为CN1321961C、CN 101698634A、CN1566349A、CN1341587A、CN101709024A的中国专利采用了从虎杖中提取白藜芦醇的方法。 在正常情况下，新生葡萄叶的白藜芦醇含量保持在较低水平。Hart JH在1979、1981年发表的 “Role of stilbene in resistance of wood to decay”（Phytopathology，1979，69：1138-1143）和“Role of phytostilbenes in decay and disease resistance”（phytopathology，1981，19：437-458）两篇文章中均提出当葡萄受到生物因素影响时，白藜芦醇含量会有明显增加，且较不稳定。 在通过各种化学诱导剂诱导葡萄白藜芦醇升高的操作中，诱导材料及处理方式的选择成为诱导的关键。譬如法国Adrian与Jeandet等人于1996年发表“Induction of phytoalexin (resveratrol) synthesis in grapevine leaves treated with Aluminum chloride”（J. Agric. Food Chem.,1996，44：1979-1981）一文中采用7月龄材料，其特征在于对葡萄叶离体扦插入氯化铝水溶液中进行诱导处理，其操作费力，无法实现大规模诱导。 在农业生产上酸性铝的植物毒性已被成为定论，譬如Foy CD等人于1978年（Annu. Rev. Plant Physiol.，29：511-566）发表“The physiology of metal toxicity in plant”一文发现即便是微量的可溶铝（20μM）也能对植物产生明显的毒害作用如抑制生长、损伤叶片。 本作品技术的有益效果在于所选择使用的诱导剂的用量在保障稳定诱导的同时，具有较高的诱导率；本技术所使用方法在叶片水平诱导白藜芦醇含量最大升高30倍；本技术所使用方法对离体叶片也有较明显的诱导作用，离体叶片白藜芦醇含量平均升高6倍。
