基本信息
- 项目名称：
- 天然蛋白交联剂京尼平的制备及初步应用研究
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 京尼平是茜草科植物黄栀子经生物转化而得到的一种天然生物交联剂。本项目利用固定化酶水解栀子苷制备京尼平，研究分离纯化工艺，摸索出稳定制备高纯度京尼平的条件，并研究其在生产栀子蓝色素以及用于制备固定化酶中的应用。
- 详细介绍：
- 京尼平（Genipin）是一种新型天然蛋白交联剂，是由茜草科植物栀子果实中的京尼平苷（亦称栀子苷）经β-葡萄糖苷酶水解而制得。京尼平能自发与含氨基的化合物形成环状的分子间和分子内交联结构[1]。近年来在生物材料[2,3]、药物合成[4]、药物控释[5]以及皮革鞣制[6]等方面受到极大的关注。京尼平的制备方法主要有2种，即酶直接水解法[7]和微生物转化法[8]。与酶直接水解法相比，微生物转化法成本低，易于实现工业化生产，但由于发酵液中存在的氨基酸可以与京尼平发生反应而显蓝色，导致收率降低，而且排出废液会使水体富营养化，对环境污染大，固定化酶法转化率高，且可反复使用。本实验利用黑曲霉（Aspergillus niger）发酵产β-葡萄糖苷酶，再用明胶、戊二醛交联海藻酸钠包埋法共固定化菌丝和β-葡萄糖苷酶，研究了固定化条件对酶活性回收率的影响，以及固定化酶的酶学性质，并研究了用固定化酶反应器栀子苷水解的最佳条件，结果栀子苷转化率可达95%以上，再将得到的京尼平转化液经大孔吸附树脂吸附分离，然后用乙醇、丙酮重结晶，最后得到的京尼平纯度达到98%以上，为高端栀子蓝色素的生产创造了条件。 栀子蓝色素（Gardenia blue pigment）是以茜草科植物栀子为原料，将其中的栀子苷采用现代生物技术水解为京尼平，再将京尼平与氨基酸反应制得的一种安全无毒的食用天然色素，它耐热、耐光、耐酸碱，pH适应范围广，易溶解于水和低醇，可替代化学合成蓝色素单独使用，也可以与红、黄类色素调配成绿、紫、棕等色调混合使用，在国外被广泛应用于食品、药品及化妆品等产品的着色。我国于1990年在制定新增食品添加剂时将其列入，用于蛋白质、糖和淀粉等食品的着色。有关栀子蓝色素的研究主要采用微生物发酵技术，如傅向阳等用杆菌发酵栀子黄废液生产栀子蓝色素[9]，肖亚中等用红曲霉发酵生产栀子蓝色素[10]，李世杰等用菌丝真菌发酵生产栀子蓝色素[11]，但有关用京尼平直接与氨基酸反应制备研究栀子蓝色素，并研究其稳定的研究较少见报道，一般都只注重研究发酵液的配方，发酵工艺，左后将发酵液过滤，喷雾干燥后得到栀子蓝色素产品。本实验比较了20种氨基酸与京尼平反应所得栀子蓝色素的色价高低，选用了高纯度的京尼平与赖氨基酸，并用分光光度法探讨了赖氨酸与京尼平反应的细化过程。以及对反应所得的栀子蓝色素的稳定性进行了研究。 固定化酶具有能够重复使用、固定化后和反应物是分开的、稳定性较高等优点，制备较高酶活的固定化酶意义重大，本次实验初步的研究了京尼平与戊二醛对照作为交联剂制备固定化β-葡萄糖苷酶的基本性质，为今后京尼平用于广泛的应用于固定化酶制备提供参考。
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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 目的：研究固定化酶水解法制备新型蛋白交联剂—京尼平的工艺，优化京尼平的生产工艺，并初步研究其应用。 基本思路：利用固定化酶水解栀子苷制备京尼平，研究京尼平的分离纯化工艺，摸索出稳定制备高纯京尼平的条件，并初步研究其在生产栀子蓝色素中的应用。
科学性、先进性及独特之处
- 科学性：京尼平是β-葡萄糖苷酶水解栀子苷后生成的产物，由于京尼平分子中隐含有独特的戊二醛结构，可以与伯氨基化合物发生交联反应。 先进性及独特之处：利用固定化酶水解法制备京尼平，不仅减少杂质的引入，而且减轻环境的污染。直接利用京尼平制备栀子蓝色素可以得到杂质少，色价高的蓝色素。
应用价值和现实意义
- 京尼平是一种天然蛋白交联剂，近年来在生物材料、药物合成以及天然色素制备等方面受到极大的关注。由于京尼平的制备技术不成熟，其应用受到一定的限制。探索出一条工艺简单的京尼平制备方法迫在眉睫。栀子蓝色素是一种安全的天然色素，在国外被广泛应用于食品、药品及化妆品等产品的着色，具有很高的应用价值。
学术论文摘要
- 研究了采用共固定化β-葡萄糖苷酶水解栀子苷制备京尼平的方法，以及京尼平的分离纯化方法，同时还建立了京尼平的高效液相色谱检测法，并初步研究了京尼平在制备高色价栀子蓝色素和固定化酶方面的应用。实验表明β-葡萄糖苷酶经质量分数为0.15 %戊二醛在20℃交联2 hr，再用海藻酸钠包埋制备成固定化酶与1%高纯度栀子苷在50℃、pH5.0反应4hr，将转化液用HPD700吸附洗脱，经旋转蒸发，乙醇的重结晶，经HPLC法检测所得京尼平纯度高于98%。通过研究20种氨基酸与京尼平的呈色反应及部分反应产物的稳定性，反应得到栀子蓝色素，测定其色价，然后研究固体状态的栀子蓝色素的光照稳定性和温度稳定性。20种氨基酸与京尼平反应后生成的栀子蓝色素最大吸收波长大都在590～600nm之间，其中赖氨酸色价E1%1cm最高达180。赖氨酸、精氨酸和甘氨酸与京尼平反应生成的栀子蓝色素色价高，稳定性好，有较好的应用价值。京尼平作为固定化酶交联剂，与戊二醛相比，酶活的损失少，回收率高。
获奖情况
- 1、《高色价栀子蓝色素的制备及其稳定性研究》被食品类核心期刊“现代食品科技”杂志录用，第一作者为本作品申报成员徐尤智； 2、《京尼平的分离纯化及高效液相色谱法测定》被中文核心期刊“食品科技”杂志录用，本作品申报成员贺玉兰和徐尤智分别为第二和第三作者； 3、《高效液相色谱法同时测定京尼平和栀子苷》被中文核心期刊“时珍国医国药”杂志录用，本作品申报成员贺玉兰和陈贺分别为第四和第五作者。
鉴定结果
- 1.实验制得的京尼平纯度达98%以上。 2.与项目有关的论文已发表两篇。 3.实验所制得的栀子蓝色素色价达到60以上。
参考文献
- [1] Sung HW, Chang Y, Chiu CT , et al. Mechanical properties of a porcine aortic valve fixed with a naturally occurring crosslinking agent. Biomaterials, 1999, 20: 1759-1772 [2]孙秀娟,范代娣,朱晨辉,等.类人胶原蛋白-透明质酸血管支架的性能及生物相容性.生物工程学报,2009, 25(4): 591-598 [3]Yung Chih Kuo,Chun Fu Yeh, Jen Tsung Yang.Differentiation of bone marrow stromal cells in poly(lactide-co-glycolide)/chitosan scaffolds.Biomaterials,2009,30:6604-6613 [4]丁克毅.铝-京尼平结合同步鞣染工艺及革的性能.中国皮革,2007,36(13):13-16 [5] Sang-Won Lee, Jong-Min Lim, Seong-Hee Bhoo. Colorimetric determination of amino acids using genipin from Gardenia jasminoides [J]. Analytica Chemica Acta, 2003, 480：267-274 [6]傅向阳，李世杰，方尚玲.杆菌发酵栀子黄废液产栀子蓝色素的摇瓶发酵优化[J].中国食品添加剂，2002，（2）：33~36 [7]肖亚中，王怡平，王金木，等.栀子蓝色素生产工艺研究[J].食品与发酵工业，2002，（7）：37~41 [8]李世杰，方尚玲，傅向阳.液态发酵产栀子蓝色素的工艺条件研究[J].食品科学，2001，（8）：46~ [9]梁华正,乐长高，廖晓峰.京尼平甙水解物与谷氨酸钠反应生成栀子蓝色素的研究[J].食品工业科技,2004,25(7):110
同类课题研究水平概述
- 1．京尼平的制备方面 从当前国内外研究京尼平制备所发表的专利、文献和资料中看出，大部分都是用微生物发酵液液水解栀子苷的方法制得，在上述的方法中主要是利用微生物所产生的酶液水解栀子苷，但在使用微生物发酵液转化过程中会带入大量的杂质，这给京尼平的纯化带来的较大的困难。所以许多国内外致力于京尼平纯化方面的科研人员所做的纯度始终在80%左右，只有日本等少数几个国家达到95%以上。 而在研究京尼平的应用方面要求其纯度必须达到98%，所以国内一直难以实现京尼平的工业化生产，直接导致国内大部分致力于京尼平应用方面研究的科研工作者都要从国外购得京尼平。而高价格的京尼平就直接限制了国内在京尼平应用方面的研究的发展。所以制备出高纯度的京尼平一直是许多从事京尼平应用方面的科研人员所期望的。 2．京尼平的应用方面 京尼平凭借着其天然、低毒、独特的生物活性及交联性质，已经被大多数学者所了解。所以在当前国内外对京尼平的应用研究也越来越多，特别是在用于制造栀子蓝色素方面的前景让人看好。传统的栀子蓝色素制作方法是通过将栀子苷酶解后投入氨基酸反应生成蓝色素再提纯，产品所含杂质较多，而且现在国内外生产的栀子蓝色素存在色价低，纯度不高等问题。另外在栀子蓝色素的制备和纯化方面，存在反应条件优化困难，纯化困难等问题，但是直接将纯度较高的京尼平与氨基酸反应制取的栀子蓝色素质量很好，容易提纯，且色价较高。随着固定化酶在生物转化中的广泛应用，提高固定化酶的酶活和使用周期具有现实意义，传统交联剂在交联酶液时对酶活的影响大，而京尼平是天然的生物交联剂，所以将京尼平作为固定化酶交联剂有很高的研究价值。
