基本信息
- 项目名称：
- 两株新的对纤维状蛋白质具有水解能力的菌株筛选和鉴定
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 角蛋白和胶原蛋白，是两种存在于自然界最广泛、最典型的纤维状蛋白质, 也是动物养殖加工业大量废料中的主要成分。如果对这些废弃物加以合理处理，既变废为宝，又符合低碳环保的理念。 本研究针对动物皮、骨等动物加工下脚料和废弃羽毛的资源化利用，对羽毛降解菌和胶原蛋白降解菌进行了筛选与鉴定。
- 详细介绍：
- 羽毛含粗蛋白约80%以上,绝大多数是角蛋白,还含有未知生长因子等。随养殖和屠宰加工业的规模发展，废弃羽毛越来越多，但因羽毛结构坚韧、角蛋白结构致密且具不溶性，普通蛋白酶很难降解，不能直接作为饲料蛋白源加以利用。目前生产上主要用高温高压、或酸碱处理将其降解后利用，有耗能高和三废排放问题，因此羽毛的微生物降解利用法受到广泛关注。已发现芽孢杆菌、黄单胞菌、放线菌和一些菌物能分泌角蛋白酶，但生物降解法目前还存在速度太慢和降解不彻底等难题，角蛋白酶高酶活新基因资源的发掘将有助于该难题的解决。本实验室在废弃羽毛的生物降解与利用研究中分离到一株高效降解羽毛角蛋白的气单胞菌，迄今为止还未见气单胞菌降解羽毛角蛋白的相关报道。 Ⅰ型胶原蛋白在哺乳动物的骨骼有机质中占80％以上。由于胶原蛋白具有生物可降解性、免疫原性低、来源广泛等优点, 正成为医药、食品和化妆品工业中的新宠。但胶原蛋白纤维因分子量大且不溶于水而难以被肌体直接吸收利用, 经胶原酶部分降解后的水溶性肽段皮肤透性大大增强, 其抗高血压、保护胃粘膜、抗衰老等生理功能和护肤防皱效果得到显著增强。生产用胶原酶主要来自微生物, 目前发现的产胶原酶细菌主要是一些假单胞菌和芽孢杆菌。本研究筛选出一株具有Ｉ型胶原蛋白高效降解作用的苏云金芽孢杆菌, 不仅为胶原酶生产提供了新的菌种资源, 还为胞外胶原酶在苏云金芽孢杆菌的杀虫抗菌和抗癌作用中的意义等研究奠定了基础。
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撰写目的和基本思路
- (1)角蛋白酶：现今羽毛（主要含角蛋白）废弃量越来越大。目前国内外对废弃羽毛的利用主要通过高温高压或强酸强碱,耗能且有污染。我们期望获得产角蛋白酶菌种。 (2)胶原酶：胶原蛋白在美白、人工皮肤领域有好的前景。但胶原蛋白分子量大、不溶于水难以被肌体吸收,经胶原酶降解后的肽段皮肤透性大大增强,于是我们希望找到能降解胶原蛋白的菌株。 研究方法都是采用的“分离-初筛-复筛-生化/分子鉴定”。
科学性、先进性及独特之处
- (1)角蛋白酶： 首次报道产高酶活角蛋白酶的气单胞菌菌株，为研究FD41菌株的安全性、开发利用价值以及角蛋白酶基因的序列结构与功能的关系等奠定了基础；首次提出了“以均一化的菌种接种量为前提的、以相对酶活为评价标准”的菌种筛选鉴定原则。 (2)胶原酶：我们作出了部分改进，将目的菌株对胶原蛋白和明胶的降解能力与其他芽孢杆菌属菌株做了比较，得出一个相对结果。这在国内的其他研究中都是没有的。
应用价值和现实意义
- (1)FD41菌株的获得，为角蛋白酶生产提供了新的菌种资源，对于采用低碳技术进行大量废弃羽毛的环境友好型转化利用，具有潜在利用价值。研究表明，气单胞菌属菌通过灭活处理后添加于饲料中，可以提高鱼类和家禽免疫力和抗病能力的作用。(2)Schenck发现捕食线虫的菌物能产生胶原酶，且其能够帮助菌体穿透宿主体壁。而罗兰等筛选出了具有杀线虫活性的苏云金杆菌。这为苏云金芽孢杆菌侵染线虫的机制提供了新的解释。
学术论文摘要
- （1）用微生物降解法对废弃羽毛加以有效利用,既可变废为宝又符合低碳环保的要求,将有助于微生物降解法中降解不彻底和速度慢等难题的解决。以半腐烂羽毛为材料,先后通过羽毛粉和酪蛋白选择培养基的初筛和复筛，得到的19个菌株中,FD41的羽毛发酵液相对酶活最高,达3.864 U/OD600 。根据FD41菌株的16S rDNA序列比对、革兰氏染色和糖发酵试验等结果,FD41鉴定为气单胞菌属细菌,这是首次报道产高酶活角蛋白酶的气单胞菌菌株。 （2）本研究通过明胶平板分离和以Ⅰ型胶原蛋白为底物的酶活鉴定, 筛选到了降解Ⅰ型胶原蛋白的菌株BC101, 其发酵液上清的酶活是10个参试菌株平均酶活的3.369倍, 而明胶水解指数处于参试菌株的最低水平, 显示BC101分泌的胞外胶原酶对Ⅰ型胶原蛋白具有突出的底物特异性。通过生理生化鉴定、16S rDNA的序列分析以及伴孢晶体染色观察, BC101菌株鉴定为苏云金芽孢杆菌。该菌株的发现不仅为胶原酶生产菌增添了新的菌种资源, 也为进一步研究胞外胶原酶产生能力对苏云金芽孢杆菌杀虫、抗菌和抗癌活性以及环境适应性的影响等奠定了基础。
获奖情况
- 1、本论文已在《微生物学通报》2011年38卷第2期第187-194页发表。 2、本作品在我校第六批学生科研创新项目结题验收中获得A等。 3、本作品为四川师范大学第七届学术科技节“挑战杯”大学生课外学术科技作品竞赛获奖论文。
鉴定结果
- 获得《微生物学通报》2011年38卷第2期录用证明。 获得四川师范大学第六届科研创新A等证书。 参与四川师范大学第七届学术科技节“挑战杯”大学生课外学术科技作品竞赛
参考文献
- 1、利用NCBI搜索引擎的文献高级搜索工具对“(Aeromonas) /(Bacillus thuringiensis) AND Keratinase[Title/Abstract]/ Collagenase [Title/Abstract]”进行搜索以及中文文献检索结果显示，到目前为止还未见气单胞菌产角蛋白酶及苏云金芽孢杆菌产胶原酶的报道。 2、本论文已发表的电子版可在《微生物学报》官方网站 3、Bijay K. Khajanchi, Amin A.Fadl, Mark A. Borchardt, et al. Distribution of Virulence Factors and Molecular Fingerprinting of Aeromonas Species Isolates from Water and Clinical Samples：Suggestive Evidence of Water-to-Human Transmission. APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY,2010,76(26):2313–2325. 4、Wu Q, Li C, Li C, et al. Purification and characterization of a novel collagenase from Bacillus pumilus Col-J.Appl biochem biotechnol, 2010, 160 (1):129-139. 5、Naoki Tsuruoka, Yuri Isono, Osamu Shida, et al. Alicyclobacillus sendaiensis sp. nov., a novel acidophilic, slightly thermophilic species isolated from soil in Sendai, Japan.Int J Syst Evol Microbiol, 2003, 53: 1081-1084. 6、傅伟,阮晖,刘婧,王金玲,陈启和,何国庆．羽毛的生物降解及其酶学性质的研究．科技通报,2008，24（3）：320-25．
同类课题研究水平概述
- （1）利用NCBI搜索引擎的文献高级搜索工具( pubmed/advanced)对“(Aeromonas) AND Keratinase[Title/Abstract]”进行搜索以及中文文献检索结果显示，到目前为止还未见气单胞菌产角蛋白酶的报道。近年来气单胞菌功能利用方面的研究取得了一些重要进展,比如对碱性孔雀绿染料的强脱色能力[10]、对铜离子的强吸附性、转化月桂酸为可降解塑料聚3-羟基丁酸-3-羟基己酸酯的功能菌、几丁质酶产生菌等。Liu等(2009)从A.schubertii分离到两种新的对SDS具有抗性的分泌型几丁质酶。已发现芽孢杆菌、黄单胞菌、放线菌和一些菌物能分泌角蛋白酶，但生物降解法目前还存在速度太慢和降解不彻底等难题，角蛋白酶高酶活新基因资源的发掘将有助于该难题的解决。迄今为止还未见气单胞菌降解羽毛角蛋白的相关报道。（2）现今的胶原酶产生菌大部分来自于细菌，已投入工业使用的有一些梭菌，芽孢杆菌。而芽孢杆菌现已报道的有枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌。未有苏云金芽孢杆菌的研究。而且目前在国内大部分的研究还停留在胶原酶蛋白质纯化方面，很少有研究胶原酶基因的，对基因的改造研究更是少。已知，苏云金芽孢杆菌具有杀虫抗菌特性，但是对其杀虫机制没有完全彻底弄清楚。现在报道的大部分跟几丁质酶和伴孢晶体有关。至于苏云金芽孢杆菌产胶原酶在这方面的研究还没有人进行。
