基本信息
- 项目名称：
- 银杏黄酮及GFP抗动脉粥样硬化作用研究
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 临床应用证实，银杏黄酮由于在体内生物利用度低，半衰期短，治疗结果尚不能令人满意。据此，我们对银杏黄酮进行结构方面的改造和加工，制备了GFP。为进一步探讨GFP抗AS作用的机理，在细胞及分子水平，以银杏黄酮为阳性对照，对GFP抗AS作用机理进行了较为系统的研究。研究结果证明，GFP抗AS作用明显优于银杏黄酮，这为进一步研制和开发新一代黄酮类抗心脑血管疾病药物提供了理论及实验依据。
- 详细介绍：
- 动脉粥样硬化（AS）是缺血性心、脑血管疾病发生的病理学基础，其并发症是导致我国中、老年人死亡的主要原因之一。目前临床上用于治疗心脑血管疾病的药物较多，但普遍存在选择性差、毒副作用较大等缺点。因此，寻求高效、低毒的心脑血管疾病治疗药物仍是新药创制的重点领域之一。 银杏、银杏黄酮的研究和应用在我国已有多年历史，药理作用明确，在治疗缺血性心脑血管疾病和呼吸系统疾病等方面疗效显著，临床应用广泛，是我国几十年来研究和开发中草药的成功范例之一，并得到了世界范围的认可。已证明，银杏黄酮是银杏的主要活性成分，然而，药代动力学研究表明，银杏黄酮在体内生物利用度低，半衰期短 (t1/2= 2.1hr)，为保持临床有效的药物治疗浓度必须频繁给药，因此而易造成体内蓄积，产生多样化的毒副反应，治疗结果尚不能令人满意。根据此特点，我们对银杏黄酮进行化学组成、结构方面的改造和加工，以银杏叶提取物 (主要含银杏黄酮) 为先导化合物，引入了具有乳化剂作用、促进脂类代谢、改善生物膜结构和功能作用的天然植物磷脂，制备了银杏磷脂复合物（ginkgo-flavone phytosomes , GFP ）。 一、银杏磷脂复合物（ GFP ）的制备： 银杏黄酮：潍坊医学院药理学教研室提取。 银杏黄酮磷脂复合物的制备:银杏黄酮溶于丙酮中→加温至60℃→按1:1摩尔比加入大豆磷脂搅拌成溶液状态→减压除去反应溶剂→加入适量氯仿，充分溶解其中的磷脂及复合物→过滤，收集滤液→减压蒸馏将氯仿蒸干，收集固体，为黄褐色粉末，置干燥器中保存。 经紫外扫描检测，大豆磷脂在400-200nm波长区无吸收峰，不干扰银杏黄酮的测定。银杏黄酮、银杏黄酮磷脂混合物、银杏黄酮磷脂复合物的紫外图谱形状相同，最大吸收峰均在254.0nm处，紫外光谱分析表明磷脂复合物中银杏黄酮的发色团结构未发生改变。证明银杏黄酮与磷脂形成的是复合物，经查新咨询未见报道。 二、银杏黄酮和GFP对氧化损伤内皮功细胞功能的影响： 1、方法：第三代细胞长至90%左右，换2%血清的培养基同步化细胞6h，随机分为6组： A组：空白对照组；B组：氧化损伤模型组；C组：银杏黄酮低浓度组（50ug/ml）；D组：银杏黄酮高浓度组（100ug/ml）；E组：GFP低浓度组（70ug/ml）；F组：GFP高浓度组（140ug/ml）。各组培养16h后，移去含药物的培养基，PBS洗2遍后加入含有100umol/L H2O2的培养基继续培养2h。 1.4指标检测：①常规MTT法检测细胞活性；②MDA和LDH检测按试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书进行；③SP免疫组化检测ICAM-1在细胞膜的表达，NF-κB在细胞核的表达；④RT-PCR检测ICAM-1 mRNA的表达。 2、结果：银杏黄酮和GFP对氧化损伤内皮细胞活性、LDH释放率、MDA含量的影响，数据以X±S（×10-2）表示，N=10，见表1。 表1 银杏黄酮和GFP对氧化损伤内皮细胞活性、LDH释放率和MDA含量的影响 组别 MTT LDH MDA A B C D E F 39.56±1.399 23.69±1.271** 28.44±1.222**# 32.37±1.692*# 33.23±1.583*# 38.49±1.020## 18.4±2.0 48.0±2.6** 35.0±2.2**# 27.1±3.1*## 26.7±2.9*## 20.5±2.6## 16.5±1.4 39.5±2.1** 30.9±2.0**# 22.8±1.4*## 23.4±2.2*## 18.1±2.5## *P<0.05 vs control group; **P<0.01 vs control group; #P<0.05 vs H2O2 group(group B); ##P<0.01 vs H2O2 group; H2O2作用于内皮细胞后，细胞活性较正常对照明显降低，LDH释放率、MDA含量则明显升高，B组与A组比较有显著差异（P<0.01）；银杏黄酮组明显提高细胞活性，降低LDH释放率和MDA含量，与B组比较有明显差异（P<0.05），且C，D两组间亦有统计学意义；说明银杏黄酮对内皮细胞氧化损伤有保护作用，且呈剂量依赖性；E，F两组具有和银杏黄酮组类似的效应，与B组比较具有显著性差异（P<0.01），F组与D组，E组与C组比较也具有统计学意义（P<0.05），说明GFP对内皮细胞氧化损伤有保护作用，且其效果优于银杏黄酮。 2.2 免疫组化检测ICAM-1在细胞膜的表达，NF-κB在细胞核的表达结果，数据以X±S（×10-2）表示，N=10，见表2； 表2 银杏黄酮和GFP对氧化损伤内皮细胞ICAM-1和NF-κB表达的影响 组别 ICAM-1 NF-κB A B C D E F 2.2±1.7 10.2±3.4** 7.9±1.6**# 5.4±1.2*## 4.9±0.9*## 1.6±0.3## 0.1±0.1 14.7±1.6** 10.1±1.5**# 4.6±1.1*## 4.3±0.7*## 0.8±0.4## *P<0.05 vs control group; **P<0.01 vs control group; #P<0.05 vs H2O2 group(group B); ##P<0.01 vs H2O2 group; 通常情况下ICAM-1在内皮细胞膜上的表达处于低水平，正常对照组的细胞膜呈浅棕黄色，胞核不着色；H2O2100μmol/L作用2h后，血管内皮细胞膜棕黄色显著加深，光密度值增高，胞核着色明显，呈深棕黄色，B组与A组比较有显著性差异（P<0.01），说明氧化损伤后内皮细胞膜表面ICAM-1表达显著增多，NF-κB活化，p65亚基移位于胞核；银杏黄酮低、高两个浓度组（C组、D组）内皮细胞膜棕黄色逐渐变浅，胞核棕黄色逐渐变浅，光密度值明显减少，与B组比较有显著差异（P<0.05），且C、D两组间亦有统计学意义，说明银杏黄酮剂量依赖性地减少细胞表面ICAM-1的表达，抑制NF-кB的活化；银杏黄酮磷脂复合物低、高两个浓度组（E组、F组）与B组比较有显著性差异（P<0.01）；分别与C、D组比较差别有显著性， E组与F组比较差别亦有显著性（P<0.05），而E组与D组无显著性差异。在分子水平进一步说明银杏黄酮磷脂复合物的作用优于银杏黄酮。 2.3 半定量RT-PCR测ICAM-1表达结果：(以Rn值表示,`X±S，N=10)，见表3。 表3 银杏黄酮和GFP对氧化损伤内皮细胞ICAM-1基因表达的影响 组别 ICAM-1（Rn） β-actin（Rn） ICAM-1（Rn）/β-actin（Rn） A B C D E F 2.59±0.31 16.42±1.80 11.17±0.69 8.71±0.92 9.38±1.17 3.54±0.58 0.32±0.14 0.40±0.11 0.35±0.19 0.32±0.14 0.29±0.12 0.39±0.15 8.09±1.76 41.05±3.07** 31.91±3.22**# 27.22±2.57**## 28.13±2.02**## 9.07±2.12## *P<0.05 vs control group;**P<0.01 vs control group; #P<0.05 vs H2O2 group(group B); ##P<0.01 vs H2O2 group; H2O2100μmol/L作用2h后，血管内皮细胞核内ICAM-1mRNA含量显著增高，B组与A组比较有显著性差异（P<0.01），说明氧化损伤后内皮细胞活化，通过信号转导，ICAM-1基因表达显著增强；银杏黄酮低、高两个浓度组（C组、D组）内皮细胞核内ICAM-1 mRNA含量逐渐减少，与B组比较有显著差异，且C、D两组间亦有统计学意义，说明银杏黄酮剂量依赖性地减轻细胞氧化损伤，抑制细胞活化，减少ICAM-1 mRNA的表达；银杏黄酮磷脂复合物低、高两个浓度组（E组、F组）与B组比较有显著性差异（P<0.01）；分别与C、D组两两比较差别亦有显著性，且E组与F组比较差别亦有显著性(P<0.01), E组与D组间无显著性差别（P>0.05），在基因水平证实了银杏黄酮对血管内皮细胞氧化损伤的保护作用以及其磷脂复合物的增效作用，并与免疫组化法测定各组ICAM-1在细胞膜上的表达结果相一致。 结果表明，氧化损伤后细胞活性下降、LDH释放增多、MDA含量增高；银杏黄酮及GFP能减轻细胞损伤，减少LDH释放和MDA的生成，抑制NF-κB的活化，减少细胞ICAM-1表达，对过氧化氢所致血管内皮细胞损伤有明显保护作用，呈现剂量依赖性，且GFP作用明显优于银杏黄酮。由此，我们得出如下结论：银杏黄酮及GFP对过氧化氢所致的血管内皮细胞有明显的保护作用，且呈剂量依赖性，GFP效果优于银杏黄酮。其机理可能是通过减少氧自由基的产生，减轻细胞损伤，抑制NF-κB活化，减少ICAM-1在细胞膜的表达等发挥作用。 三、银杏黄酮和GFP对缺血再灌注损伤大鼠内皮功能的影响： 1、分组与给药： 健康成年雄性Wistar大鼠40只，体重150-200g，随机分为4组，每组10只。在造模前，每日灌胃1次，共灌胃14天。假手术组和模型组：以鼠正常饲料、普通饮水饲养70天。每日上午给予生理盐水灌胃1ml/kg。银杏黄酮组：每天上午给予银杏黄酮乳剂灌胃90mg/kg；银杏黄酮磷脂复合物组：每天上午给予银杏黄酮磷脂复合物乳剂灌胃90mg/kg。 2、造模：按常规方法制备缺血再灌注损伤模型； 3、结果：1）银杏黄酮及GFP对大鼠心肌再灌注血管内皮ET1、PGI2和TXA2的影响，见表4； 表4 银杏黄酮及GFP对缺血再灌注大鼠血清ET1、PGI2和TXA2的影响（`X±S, n=10） 组别 ET1 PGI2 TXA2 PGI2/ TXA2 假手术组 69.85±13.09 377.60±35.67 294.71±45.79 1.29±0.31 模型组 168.14±24.32* 206.86±34.72* 520.13±37.53* 0.39±0.05* 银杏黄酮组 131.39±20.41# 259.18±63.63# 429.01±73.64# 0.66±0.21# GFP组 110.31±23.44**△ 307.99±42.33**△ 351.31±39.4**△ 0.89±0.18**△ 注：*与假手术组比较，P<0.01；#与模型组比较，P<0.05；**与模型组比较，P<0.01;△与银杏黄酮组比较，P<0.05 从表4中可见，模型组各项指标与假手术组比较，均有显著差异（P<0.01），表明缺血再灌注后血浆中缩血管物质明显升高，而扩血管物质明显降低，PGI2与TXA2的比例失调，造模成功。两药物组各项指标与模型组相比，亦有显著差异（分别为P<0.05， P<0.01），表明对大鼠预先给予药物干预后，可明显改善缩血管与扩血管物质的比例失衡，从而达到保护血管内皮的功能，而两药物组之间，亦有明显差异(P<0.05)，表明GFP对改善这种比例失衡的作用要比银杏黄酮更强，保护血管内皮的作用更好。 2）银杏黄酮及GFP对大鼠心肌再灌注血管内皮NO、SOD和MDA的影响，见表5； 表5 银杏黄酮及GFP对大鼠心肌再灌注血管内皮NO、SOD和MDA的影响 组别 NO MDA SOD 假手术组 32.37±8.21 4.71±1.09 176.23±29.98 模型组 103.74±25.42* 16.43±5.93* 98.90±12.64* 银杏黄酮组 83.19±9.57# 12.12±2.26# 122.23±13.21# GFP组 63.51±8.79△ 8.29±2.55△ 144.23±15.13△ 注：*与假手术组比较，P<0.01；#与模型组比较，P<0.05；**与模型组比较，P<0.01;△与银杏黄酮组比较，P<0.05 从表中可见，模型组各项指标与假手术组比较，均有显著差异（P<0.01），表明缺血再灌注后自由基生成明显增多，而自由基清除剂明显减少。两药物组各项指标与模型组相比，亦有显著差异（分别为P<0.05， P<0.01），表明对大鼠预先给予药物干预后，可减少体内自由基的生成，增强自由基清除剂的活性，从而减少自由基对血管内皮的损伤。而两药物组之间，亦有明显差异(P<0.05)，说明GFP对减少自由基生成，增强抗氧化酶活性的作用要比银杏黄酮更强，从而说明其保护血管内皮的作用更好。 根据上述实验结果，我们得出如下结论： 一、对过氧化氢所致血管EC损伤的保护作用 1、银杏黄酮及GFP对过氧化氢导致的EC损伤有保护作用,其机制可能是直接清除过氧自由基、提高细胞抗氧化能力、抑制炎症反应的信号通路NF-кB活化及炎症相关基因ICAM-1的表达； 2、GFP效果优于银杏黄酮,与其提高银杏黄酮的溶解度,增加与生物膜的亲和性从而提高其生物利用度有关； 3、银杏黄酮及GFP对过氧化氢导致的内皮细胞损伤有保护作用在一定浓度范围内有剂量依赖性。 二、抑制大鼠AS的作用 1、GFP可能通过抑制NF-B的活化进而抑制iNOS、NO、TNF-α等相关因子的表达增强来抑制AS病变的发生发展；结果表明，GFP抗AS作用强于银杏黄酮； 2、免疫组化实验表明，银杏黄酮和GFP可以抑制高脂血症引起的主动脉壁ICAM-1基因的蛋白表达；GFP的作用明显优于银杏黄酮。
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撰写目的和基本思路
- 目的：研究银杏黄酮磷脂复合物（GFP）对过氧化氢所致血管内皮细胞损伤的保护作用，在分子水平探讨药物的作用机制，为开发新一代治疗缺血性心、脑血管疾病药物提供理论及实验依据。思路：培养人脐静脉内皮细胞，用过氧化氢复制内皮细胞氧化损伤模型，以银杏黄酮为阳性对照药物，用不同浓度的GFP预处理实验组的内皮细胞后，运用免疫组化、分子生物学等技术方法，观察GFP对内皮细胞氧化损伤的保护作用，并探讨其作用机理。
科学性、先进性及独特之处
- 1、临床应用证实，银杏黄酮由于在体内生物利用度低，半衰期短，治疗结果尚不能令人满意。据此，我们对银杏黄酮进行结构方面的改造和加工，制备了GFP，经电镜、紫外光谱、红外光谱分析和药代动力学参数测定表明，该复合物与银杏黄酮和银杏黄酮、磷脂的混合物明显不同，证明银杏黄酮与磷脂形成的是复合物，经查新咨询尚未见国内外相关研究和文献报道。2、我们研究结果表明，GFP抗AS作用明显优于银杏黄酮。
应用价值和现实意义
- 我们的初步研究结果表明，GFP抗AS作用明显优于银杏黄酮。这为进一步探索黄酮类天然药物抗AS作用的分子机理，研制和开发新一代黄酮类抗心脑血管疾病药物提供了理论及实验依据，具有很大临床应用价值和广阔市场前景。
学术论文摘要
- 目的：以银杏黄酮为阳性对照药物，观察银杏黄酮磷脂复合物（GFP）对H2O2所致血管内皮细胞损伤的保护作用，在分子水平探讨药物的作用机制。方法：培养人脐静脉内皮细胞，用H2O2复制氧化损伤模型，用不同浓度的银杏黄酮和GFP预处理实验组的内皮细胞16h后，H2O2 100umol/L孵育2h。然后MTT法检测各组内皮细胞的活性；试剂盒检测细胞LDH的释放率及培养液中MDA含量；利用免疫组化观察血管细胞粘附分子（ICAM-1）和核因子κB（NF-κB）在不同组的表达量；RT-PCR观察ICAM-1在不同组的表达差异。结果：氧化损伤后细胞活性下降、LDH释放增多、MDA含量增高；银杏黄酮及GFP能减轻细胞损伤，减少LDH释放和MDA的生成，抑制NF-κB的活化，减少细胞ICAM-1表达，对H2O2所致内皮细胞损伤有明显保护作用，呈现剂量依赖性，且GFP作用明显优于银杏黄酮。结论：银杏黄酮及GFP对过氧化氢所致的血管内皮细胞有明显的保护作用，且呈剂量依赖性，GFP效果优于银杏黄酮。其机理可能是通过减少氧自由基的产生，减轻细胞损伤，抑制NF-κB活化，减少ICAM-1在细胞膜的表达等发挥作用。
获奖情况
- 1、论文《银杏黄酮及GFP对血管内皮细胞氧化损伤的保护作用研究》已被《山东医药》杂志接受； 2、论文《银杏黄酮及GFP抗动脉粥样硬化作用研究》已被潍坊医学院学报接受。
鉴定结果
- 该项目有一定创新性，设计合理，技术路线严谨，技术资料完整，实验数据准确，国内未查到与本项目查新点相同的研究报道。综合评审达国内领先水平。 建议对GFP的临床应用进行深入的研究。
参考文献
- [1] 姚义安,张抒扬.内皮细胞与动脉粥样硬化[J].中华内科杂志, 2008, 1:63-64. [2] 朱红,王德伟,高尔.银杏黄酮磷脂复合物的制备及其理化性质的研究[J].潍坊医学院学报,2007,29（5）:432-433. [3] Rong Y, Geng Z, Lau BH. Ginkgo biloba attenuates oxidative stress in macrophages and endothelial cells[J]. Free Radic Biol Med ,1996,20(1):121-127. [4] Blann AD,Lip GYH.The endothelium in atherothrombotic diseases:assessment of function, mechanisms and clinical implica-tions[J].Blood Coag Fibrinolys,1998,9: 297-306. [5] 钱大青,张根葆,刘德蔚. 银杏叶提取物对豚鼠离体小肠平滑肌活动的影响[J]. 咸宁医学院学报,2000,14(2):91-93. [6] Li L, Lau BH. A simplified in vitro model of oxidant injury using vascular endothelial cells[J]. In Vitro Cell Dev Biol Anim 1993 ,29A(7):531-536. [7] Brand K. Activated transcription factor nuclear factor-kappa B is present in the atherosclerosis lesion[J]. J Clin Invest, 1996,97(10):1715-1722. [8] Collins T, Cybulsky MI. NF-kappaB: pivotal mediator or innocent bystander in atherogenesis[J] J Clin Invest,2001,107(3):255-64.
同类课题研究水平概述
- 动脉粥样硬化（AS）是缺血性心、脑血管疾病发生的病理学基础，其并发症是导致我国中、老年人死亡的主要原因之一。目前临床上用于治疗心脑血管疾病的药物较多，但普遍存在选择性差、毒副作用较大等缺点。因此，寻求高效、低毒的心脑血管疾病治疗药物仍是新药创制的重点领域之一。 银杏黄酮的研究和应用在我国已有多年历史，药理作用明确，在治疗缺血性心脑血管疾病和呼吸系统疾病等方面疗效显著，并得到了世界范围的认可。然而，药代动力学研究表明，银杏黄酮在体内生物利用度低，半衰期短 (t1/2= 2.1hr)，其治疗结果尚不能令人满意。据此，我们对银杏黄酮进行结构方面的改造和加工，以银杏黄酮为先导化合物，引入了具有乳化剂作用、促进脂类代谢、改善生物膜结构和功能作用的天然植物磷脂，制备了银杏磷脂复合物（ginkgo-flavone phytosomes , GFP ），经电镜、紫外光谱、红外光谱分析和药代动力学参数测定表明，该复合物与银杏黄酮和银杏黄酮、磷脂的混合物明显不同，证明银杏黄酮与磷脂形成的是复合物，经查新咨询未见报道。 为进一步探讨GFP抗AS作用的机理，利用多种技术和方法，在细胞及分子水平，以银杏黄酮为阳性对照，对GFP抗AS作用机理进行了以下较为系统的研究：①血管内皮细胞（EC）氧化损伤的保护作用：培养人脐静脉内皮细胞，制备内皮细胞（EC）氧化损伤模型，检测EC活性、LDH和MDA水平，NF-κB和ICAM-I表达；②大鼠心肌再灌注血管内皮损伤的保护作用：健康Wister大鼠随机分为假手术组，模型组，银杏黄酮保护组及GFP保护组，检测各组ET1、PGI2、TXA2水平及血清NO、MDA水平及SOD活性；结果表明：①过氧化损伤后，血管EC活性降低，LDH释放增多，MDA含量升高，银杏黄酮磷脂复合物能明显减轻EC损伤，提高EC抗氧化能力，并能抑制NF-κB活性，降低细胞膜表面ICAM-I的表达，对损伤EC有明显保护作用，呈剂量依赖性，且GFP作用明显优于银杏黄酮。②GFP对心肌再灌注大鼠可明显降低血清NO及MDA含量，而使SOD活性增强，PGI2水平增高，亦使血清ET1、TXA2水平下降，且GFP作用明显优于银杏黄酮。这为进一步探索黄酮类天然药物抗AS作用的分子机理，研制和开发新一代黄酮类抗心脑血管疾病药物提供了依据，具有很大临床应用价值和广阔市场前景。
