基本信息
- 项目名称：
- 新型生物源植物生长物质冠菌素的研制
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 科技发明制作B类
- 简介：
- 本作品以耐受高温的产冠菌素新型菌株筛选为基础，优化其发酵条件，将发酵产物应用于桑树生理多相调节。 （1）从高温爆发桑疫病的致病菌中分离具有自主知识产权的产冠菌素菌株M4-13、S2-15和L2，打破传统产冠菌素菌株最高耐受28℃的限制； （2）模拟产冠菌素菌株的原始生境优化培养基，设计变温发酵模式，合成产量提高了300%； （3）冠菌素发酵液显著提高了桑树中次生代谢产物含量。
- 详细介绍：
- 冠菌素（Coronatine, C18H25NO4）是一种新型高效的生物源植物生长物质，能有效促进植物次级代谢合成，其活性比茉莉酸高100~10000倍。当前，化学合成冠菌素成本过高，而发酵生产冠菌素受到“菌株耐受温度低”和“发酵产量过低”两大瓶颈限制。 本作品的主要内容： （1）从高温爆发桑疫病的致病菌中分离具有自主知识产权的产冠菌素菌株M4-13、S2-15和L2，打破传统产冠菌素菌株最高耐受28℃的限制； （2）模拟产冠菌素菌株的原始生境优化培养基，设计变温发酵模式，合成产量提高了300%； （3）冠菌素发酵液显著提高了桑树中次生代谢产物含量，当冠菌素浓度1 μmol/L时，桑叶中1-DNJ提高了180%，黄酮提高了80%。 阶段性成果：目前作品已经发表了6篇学术论文（1篇英文被EI收录,2篇英文被ISTP收录，中文核心2篇，国内会议1篇），同时申请了1项专利。
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作品专业信息
设计、发明的目的和基本思路、创新点、技术关键和主要技术指标
- 本作品的发明目的旨在解决生物合成冠菌素及其应用过程中存在三个的主要问题:（1）已报道合成冠菌素的菌株最高耐受温度≤28℃；（2）发酵培养基组成与产冠菌素菌株的原始生境条件不符导致发酵产量较低；（3）促进桑树次生代谢缺乏高效的生长调节剂。最终，建立具有自主知识产权的低碳、高效和高产冠菌素生物合成工艺。 基本思路:（1）从爆发桑疫病的高温桑园分离新型产冠菌素菌株，提高产冠菌素菌株的最高耐受温度；（2）模拟产冠菌素菌株原始生境优化培养基，设计变温发酵模式，提高冠菌素生物合成产量；（3）将冠菌素应用于调节桑树的次生代谢，提高桑树组织中功能性次生代谢产物的含量。 创新点:（1）筛选获得具有自主知识产权的耐温冠菌素积累菌株桑丁香假单胞菌M4-13（Pseudomonas syringae pv. mori VanHall M4-13，保藏编号CGMCC3621）、S2-15和L2。（2）提出微环境调控冠菌素发酵的思路，模拟产冠菌素菌株的原始生境优化培养基，优化冠菌素合成的发酵模式和工艺条件。（3）将冠菌素应用于调节桑树的次生代谢以提高其功能性次生代谢产物的含量。 技术关键和主要技术指标:（1）从高温爆发桑疫病的致病菌中分离到3株具自主知识产权的产冠菌素菌株，进行菌落形态、生理生化、合成冠菌素能力和16S rDNA分子鉴定。（2）冠菌素积累的微环境发酵条件优化：模拟产冠菌素菌株的原始生境设计变温发酵模式，重点从新碳源、电解质和金属离子等方面优化发酵条件，部分成果已递交专利申请。
科学性、先进性
- 科学性：特殊生境法筛选新型耐高温的高产冠菌素菌株。 （1）桑疫病致病菌为丁香假单胞菌致病变种，产冠菌素野生型菌株亦为此类； （2）桑园夏季高温常达40℃以上，为寻找产冠菌素的耐高温发酵菌株提供了可能。 通过江苏、广西、四川等地的桑园桑疫病爆发季节的叶片和土壤中筛选到M4-13、S2-15和L2。 先进性：模拟原始生境构建低碳、高效和高产的发酵工艺。 （1）低碳：本作品的发酵所需要积温比目前文献报导最低的322日×度（28℃×7d＋18℃×7d）低100日×度（我们的为：32℃×3d＋18℃×7d＝222日×度）；降低31.06%。 （2）高效：本作品的全程发酵所需要天数为10d，比目前文献报导最短的14d缩短了4d，效率提高28.57%。 （3）高产：本作品冠菌素发酵产量由20mg/L提高至80mg/L，提高了300%。 （4）实用性：当冠菌素浓度1 μmol/L时，桑叶中降血糖成分1-DNJ提高了180%，降血压成分桑叶黄酮提高了80%。
获奖情况及鉴定结果
- [1]ICNPTM2010, Scientific and Technical Development Press. 2010, pp. 105-109.（ISTP） [2]ICNPTM2010, Scientific and Technical Development Press. 2010, pp. 110-114. (ISTP) [3]Advanced Material Research, 2011.(已录用, EI和ISTP) [4]冠菌素生物合成的研究进展[J]，现代化工，2011,31,（5）：25-29.（核心）。 [5]生物合成冠菌素的桑丁香假单孢菌发酵条件，现代化工，录用，2011年增刊（核心） [6]用于发酵产冠菌素的红糖培养基[P]. 已递交专利申请。
作品所处阶段
- A实验室阶段
技术转让方式
- 合作开发，专利转让
作品可展示的形式
- 实物、产品、图片
使用说明,技术特点和优势,适应范围,推广前景的技术性说明,市场分析,经济效益预测
- 1、使用说明 本作品基于特殊生境法筛选新型产冠菌素菌株，具有选择性好、准确性高的技术特点，模拟原始生境的变温发酵工艺在发酵过程优化方面具有良好的操作性，冠菌素促进桑树组织次生代谢为其他药用植物中药效成分的高效代谢和积累提供宝贵借鉴。 2、技术特点和优势：本技术融“特殊生境法筛选新型产冠菌素菌株，模拟原始生境的变温发酵工艺，冠菌素应用于植物次生代谢调控”于一体，具有很高的科学性、创新性及实用性。 3、适用范围 （1）特殊生境法筛选新型产冠菌素菌株可以应用于其他工业微生物菌株的筛选；（2）模拟原始生境的变温发酵工艺可以借鉴并应用于其他生物产品的发酵生产过程中；（3）自制冠菌素可以促进植物次生代谢产物的积累。 4、市场分析和经济效益预测 （1）冠菌素绿色环保，可大规模应用于农业生产；（2）冠菌素促进植物次级代谢，可建立新型蚕桑产业链，极大提高产业效益；（3）提供高品质桑叶，开发药品和保健品，市场前景广阔。
同类课题研究水平概述
- 冠菌素（Coronatine，COR）于1977年首次被发现，对于冠菌素纯品获得的研究一直是植物生长物质领域的热点。 1.冠菌素的化学合成 市原狄民等对化学合成冠菌素进行深入的研究，成功建立化学合成方法。其中，合成冠菌酸外消旋体需要7步，合成冠烷酸需要6步，由冠烷酸和冠菌酸合成冠菌素需要2步。经过所有步骤后，冠菌素得率仅有6.98%，而且合成费用较高，过程繁杂，仅能满足实验室做少量机理研究，无法实现大规模工业化生产。 2.冠菌素的生物合成 1985年，Mitchell等人提出了L-异亮氨酸和L-别异亮氨酸为生物合成冠菌素的中间产物。之后的研究阐明了这一过程，首先由L-异亮氨酸形成L-别异亮氨酸，再经环化作用，即: L-别异亮氨酸在C-2和C-6位脱去两个氢原子形成环丙烷式的结构，由此形成冠氨酸，而冠烷酸是由三单位乙酸盐、一单位丙酮酸盐和一单位丁酸盐前体构成的聚酮体。文献表明，发酵法是目前生物合成冠菌素最有潜力的方法。 3.冠菌素发酵条件的优化 冠菌素是细菌的次级代谢产物，是与菌体生长直接相关的，传统菌株产冠菌素活性一直存在低温限制，因此，产冠菌素的发酵条件需要在菌体生长与冠菌素积累两方面平衡，温度作为菌体生长与产冠菌素活性的双重影响因子起着至关重要的作用。冠菌素的积累受到多因素影响：（1）最高耐受温度（≤28℃）是影响冠菌素合成的重要条件；（2）由于冠菌素属于胞外产物，转速（溶氧）、pH等因素都极大地影响冠菌素的积累；（3）冠菌素发酵受菌体生长和产冠菌素活性的两方面影响。 因此，发酵生产冠菌素需要解决三个问题：（1）筛选耐高温、高产量的出发菌株；（2）基于产冠菌素发酵的温度曲线设计变温发酵模式；（3）优化获得最佳的冠菌素胞外分泌积累以及菌体生长的营养条件。
