基本信息
- 项目名称：
- 蛹虫草深层培养产纤溶酶工艺及纤溶酶分离纯化的研究
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 本实验项目以纤溶酶活力为指标，通过摇瓶培养方式对蛹虫草的液体发酵条件进行优化处理，确定最佳发酵条件，按拟确定的最佳发酵条件在发酵罐中进行比拟放大，利用层析法对蛹虫草发酵液进行分离提纯，确定最佳分离路线。
- 详细介绍：
- 对蛹虫草液态发酵产生纤溶酶的培养基和发酵控制参数进行优化，通过分析得到液体发酵产纤溶酶的最佳工艺条件为：蔗糖2%、豆饼5%；250mL三角瓶装液量50mL；发酵时间为5天；蔗糖/豆饼比为2：5；发酵培养基的初始pH值为自然（约6-7之间）；发酵培养接菌量为直径为1cm的菌片1片；最适培养温度为21-25℃。在10L发酵罐中的放大结果显示，在搅拌转速和通风量为100r/min，600L/h的条件下纤溶酶的溶圈面积可达214.28mm2，相当于尿激酶286.21U/mL，较摇瓶条件下的酶活力提高了3.2倍。蛹虫草通过深层发酵产生的纤溶酶经过硫酸铵盐析、Octyl Sepharose FF疏水作用层析、Superdex 75 凝胶过滤层析进行分离纯化。样品经Octyl Sepharose FF疏水作用层分离得到两个活性组分，本实验收集活性组分II进一步纯化，最终纤溶酶活性组分II达到了电泳纯。提纯后的蛹虫草纤溶酶II比活力达到2197.66 U/mg，活力回收率为7.85%，纯化了68.82倍。
作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 心脑血管疾病给国家、社会、家庭带来严重的精神负担和经济负担，血栓栓塞症是其主要一类。所以溶栓剂的研究与开发具有重要意义。微生物生长迅速，活动周期短，生长条件易控制，研究微生物产溶栓剂具有广阔的发展前景。本实验以纤溶酶活力为指标，通过摇瓶培养方式对蛹虫草的液体发酵条件进行优化处理，确定最佳发酵条件，按拟确定的最佳发酵条件在发酵罐中进行比拟放大，利用层析法对蛹虫草发酵液进行分离提纯，确定最佳分离路线。
科学性、先进性及独特之处
- 本实验贯穿了从蛹虫草深层培养产纤溶酶的优化培养体系到大规模生产体系到分离纯化体系的建立，这一系列体系的建立为蛹虫草纤溶酶的工业化生产和临床应用奠定了一定的基础。目前，国内外对药用大型真菌深层培养产生生理活性蛋白方面的研究报道较少，研究工作主要集中在优化培养条件使菌丝体收获量提高和提高代谢产物多糖产量及其生理功能方面。蛹虫草纤溶酶的开发利用有望弥补目前临床使用的溶栓药物的缺陷。
应用价值和现实意义
- 作为治疗和预防血栓栓塞性疾病的主要药物，溶栓剂的研究与开发具有重大的经济效益和社会效益。第一代和第二代溶栓剂在临床应用方面不能尽如人意，第三代溶栓剂还很少投入临床使用，且基因药品投入使用需要经过较长的试用期。因此溶栓剂的发展应该是在继续第三代溶栓剂开发的同时，把眼光投向从微生物代谢产物中筛选具有更高溶栓效率、更高溶栓选择性、更长半衰期、更小副作用的新型溶栓剂。所以，本实验成果具有广泛的实用价值。
学术论文摘要
- 本论文对蛹虫草产纤溶酶的深层培养工艺条件进行了优化，在10L发酵罐中放大成功，并建立了纤溶酶的分离纯化流程。对蛹虫草液态发酵产纤溶酶的培养基和发酵控制参数进行优化，通过分析得到液体发酵产纤溶酶的最佳工艺条件为：蔗糖2%、豆饼5%；250mL三角瓶装液量50mL；发酵时间为5天；蔗糖/豆饼比为2：5；发酵培养基的初始pH值为自然（约6-7之间）；接菌量为直径为1cm的菌片1片；最适培养温度为21-25℃。在10L发酵罐中的放大结果显示，在搅拌转速和通风量为100r/min，600L/h的条件下纤溶酶的溶圈面积可达214.28mm2，相当于尿激酶286.21U/mL，较摇瓶条件下的酶活力提高了3.2倍。蛹虫草通过深层发酵产生的纤溶酶经过硫酸铵盐析、Octyl Sepharose FF疏水作用层析、Superdex 75 凝胶过滤层析进行分离纯化。样品经Octyl Sepharose FF疏水作用层分离得到两个活性组分，本实验收集活性组分II进一步纯化，最终纤溶酶活性组分II达到了电泳纯。提纯后的蛹虫草纤溶酶II比活力达到2197.66 U/mg，活力回收率为7.85%，纯化了68.82倍。
获奖情况
- 无
鉴定结果
- 无
参考文献
- [1] Alexopoulos C J,Blackwell M,Mims C W.菌物学概论（第四版）[M].北京：中国农业出版社，2002 [2] Bok J W,Lermer L,Chilton J.Antitumor sterols from the mycelial of Cordyceps sinensis[J].Phytochemistry,1999,51:891-898. [3] Cunningham KG, Manson W , Spring FS, et al.Cordycepin, a Metalmlic Product Isolated from Cultures of Cordyceps Militaris(Lim•)Link.Nature, 1950, 2: 166(4231): 949 [4] IKUMOTOT，SASAKIS，NAMBAH，et al.physiologically active compounds in the extracts from tochukaso and cultured mycelia of Cordyceps and Isaria[J].Yakygaku Zasshi.1991， 111(9)504-509. [5] 鲁艳莉,宁喜斌.血栓形成机理及溶血栓药物的研究进展.食品研究与开发,2006,27.(1)
同类课题研究水平概述
- 韩国的Wodeuk.Kim等从芽孢杆菌（Bacillus sp.CK-114）的分泌物中分离纯化得到了一种分子量为28.2KDa的纤溶酶，命名为枯草激酶（CK）。CK的最适温度为70℃，具有较好的热稳定性，与同类的枯草杆菌蛋白酶激酶相比具有2003年华东师范大学徐同课题组将蛹虫草固态发酵所获得的蛹虫草材料（菌丝体）经10mmol/L PBS(pH8.04)和石英砂研磨，所得提取液经离心(4℃,10000rpm,10min)和70%饱和度(NH4)2SO4沉淀后，即可得到具有纤溶活性的粗酶液，命名为“蛹虫草纤溶酶”；李翠（2008年）从蛹虫草深层培养液中分离纯化得到纤溶酶并对其部分酶学性质进行了研究。
