基本信息
- 项目名称：
- 新型丙型肝炎病毒定量PCR检测试剂盒的研制
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 科技发明制作A类
- 简介：
- 我们设计了一类新型二聚体突变引物，实现的探针的单标记，克服了Taqman探针技术成本高、检测时间较长的缺点。采用该技术进行了丙型HCV定量检测，并进行了方法学评价以及与Taqman探针技术进行了方法对比，数据显示本试剂盒的检测性能达到了现今同类产品的水平，在检测成本和检测时间上有明显优势。
- 详细介绍：
- 我们研发了一类新型二聚体荧光突变引物，将荧光报告基团标记在引物上，而淬灭基团标记在与荧光引物互补的寡核苷酸链上，即两条互补的寡核苷酸只分别标记了相应的淬灭或者报告基团。这种结构设计可巧妙地回避对淬灭链末端进行封闭，因为它虽与引物互补，而3’端已被淬灭基团阻断，而PCR不能从5’端延伸，所以不需要对5’端进行磷酸化阻断；而引物仅5’端标记了荧光报告基团，引物与靶基因结合后，可从3’端延伸完成靶基因复制。这样，实现了真正的单标记结构，故合成、纯化简单且成本低，克服了普通多标记探针法成本高的难题。此外，为达到根据real-time PCR原理，准确定量的目的，我们在和荧光引物互补的淬灭链序列中，人为设计一个碱基突变。无靶基因时，两者将相互结合产生FRET，不会发射荧光。一旦标本中存在靶基因，由于荧光引物与靶基因完全互补，而淬灭链存在1个突变碱基，所以在较高温度下，荧光引物与靶基因的亲和力大于与淬灭链间的亲和力，从而优先和靶基因结合，在PCR体系中发挥普通引物引导延伸的功能，标记的荧光基团随引物整合在新生PCR产物中起探针的指示作用，即所有新生PCR产物均被荧光基团标记。此时，FRET被破坏，忠实反映PCR产物量的荧光信号可被实时定量检测。根据上述分析，从理论上说应用我们建立的这一检测系统，根据扩增时荧光信号的增加，可准确进行基因定量。并且，由于引物具有高度特异性，产生的荧光信号也是高度特异的，既具备探针法的特异性，而又不用单独设计荧光标记的探针，同时又具有染料法设计简单、价廉的优点。目前荧光定量PCR仪已在医院广泛应用，该系统可直接在临床检验中推广应用。因此，新型二聚体荧光突变引物具有精确定量、标记简单、成本低廉的优点，符合临床检测方法要求的可靠、实用两大原则，将其开发成高通用性，易于推广普及的核酸定量技术，可在感染性疾病、肿瘤、遗传疾病、基因表达等领域广泛应用。在感染性疾病的临床检测中，定量PCR技术多用于一些临床培养难以开展或者培养周期较长的病原体，如：各种病毒、结核分枝杆菌、支原体、沙眼衣原体等，也有用于耐药基因检测的报道。本研究中，我们拟选择HCV为研究对象，通过与其它临床检测方法比较和方法学评价，对基于新型二聚体突变引物的荧光定量PCR技术，进行系统的方法学评价，证实其可行性，并探讨其临床应用价值。
作品专业信息
设计、发明的目的和基本思路、创新点、技术关键和主要技术指标
- 荧光定量PCR的定量技术多种多样，主要分为荧光染料技术和荧光探针技术。荧光染料技术特异性不高，荧光探针技术虽然特异性好，但是常用的Taqman探针技术主要存在两大问题：一是在探针的两端标记两个荧光基团，标记和纯化难度高；二是Taqman探针的发光需要Taq酶的水解作用，对Taq酶的要求高，反应时间较长。我们研发了一类新型二聚体荧光突变引物，将荧光报告基团标记在引物上，而淬灭基团标记在与荧光引物互补的寡核苷酸链上，即两条寡核苷酸只分别标记了相应的淬灭或者报告基团。这种结构设计巧妙地回避了对淬灭链末端进行封闭，因为它虽与引物互补，而3’端已被淬灭基团阻断，而PCR不能从5’端延伸，所以不需要对5’端进行磷酸化阻断；5’端标记了荧光报告基团的引物与靶基因结合后，可从3’端延伸完成复制。并且应用到丙型肝炎病毒（HCV）定量检测中。
科学性、先进性
- 本项目以荧光共振能量转移为理论基础，基于该基础开发的各种探针技术，在科研和临床诊断中已广泛应用，从理论讲，本项目设计思想是可行的。首次提出新型二聚体荧光突变引物，以及基于此建立新型real-time PCR系统的科学设想。其既有探针法特异性高的优点，又克服了其设计复杂、合成成本高的难题，为real-time PCR技术进行定量检测提供了新思路和新方法。本项目不仅学术思想创新性强、密切结合临床需求，具有较高的科学性和社会价值，而且可直接转化开发，生产具有完全自主知识产权的商品化试剂盒，打破国外垄断，创造良好的经济效益。
获奖情况及鉴定结果
- 2011年5月，海南省大学生“挑战杯”决赛二等奖。
作品所处阶段
- 临床初步试用检测阶段。
技术转让方式
- 整体有偿转让。
作品可展示的形式
- 可在墙报或以论文形式展示。
使用说明,技术特点和优势,适应范围,推广前景的技术性说明,市场分析,经济效益预测
- 1.结构上具有天然的“热启动”功能，增加了方法的特异性； 2.荧光报告基团和淬灭基团空间距离近，报告基团可被有效抑制，降低了方法的本底，一旦扩增开始两者便彻底分离，产生的荧光信号强，增加了方法的灵敏度； 3.真正实现荧光探针的单标记，降低了合成、纯化难度，因此降低了成本。 4.二聚体突变引物可采用快循环，根据PCR速度最快，而不影响荧光曲线的原则选择循环参数。 5.具有高通用性，可在国产和进口定量PCR仪上使用。 可用于所有核酸定量检测，可在肿瘤、遗传疾病、感染性疾病、基因表达等领域广泛应用。与目前市场上广泛使用的TaMan技术相比具有成本低、检测时间短的优势，可产生良好的经济效益。
同类课题研究水平概述
- 实时聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）技术分为内掺式染料技术和探针技术两类。内掺式染料技术方法简单，成本较低，但特异性差，故不适于临床检测。探针技术采用了基于荧光淬灭原理或荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer, FRET）的探针，包括TaqMan探针、Amplifluor探针、分子信标、蝎型探针等。这些探针均是在与模板互补的同一寡核苷酸链上，分别标记荧光基团和淬灭基团，特异性高，定量准确，因而被广泛应用于临床诊断中。但这些探针均属于多标记探针，其合成难度和成本较高，制约了其推广应用。不少研究人员试图采用单标记探针来降低合成难度和成本，如杂交探针（hybridization probes）和荧光置换探针（displacing probes），取得了较好效果。但为防止探针与靶序列杂交引起自身延伸而被破坏，仍然需要在探针末端磷酸化来阻断其延伸，因此，并非真正意义的单标记探针技术。基于上述分析，本课题设计了一种全新的二聚体突变引物，其具有独特的结构，为真正意义的单标记探针。与其它多标记荧光探针相比，二聚体突变引物有以下优点： 1. 结构上具有天然的“热启动”功能，增加了方法的特异性； 2. 荧光报告基团和淬灭基团空间距离近，报告基团可被有效抑制，降低了方法的本底，一旦扩增开始两者便彻底分离，产生的荧光信号强，增加了方法的灵敏度； 3. 真正实现荧光探针的单标记，降低了合成、纯化难度，因此降低了成本。这种新型定量检测系统既具有染料法对新生双链DNA均能示踪、成本低的特点，又具有探针法高特异性，是一种高通用性、高特异性和灵敏性、操作简单、价廉的新型real-time PCR技术。
