基本信息
- 项目名称：
- 丹参酮高产的丹参发根生物反应器的研制
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 科技发明制作A类
- 简介：
- 丹参酮是临床治疗心、脑血管疾病的重要药物资源。本作品将丹参酮代谢途径中的关键代谢酶基因HMGR，DXS及GGPPS分别单独或同时遗传转化丹参获得发根。结果显示，在丹参毛状根中过量表达SmDXS，SmHMGR，SmGGPPS基因显著提高丹参酮产量，且SmHMGR和SmGGPPS组合可以产生协同作用。本研究为利用代谢工程策略大规模商业化生产丹参酮提供了新思路。
- 详细介绍：
- 心脑血管疾病是当今世界上威胁人类健康的“头号杀手”。 丹参 (Salvia miltiorriza) 为我国传统名贵中药材，其主要成分包括脂溶性的丹参酮化合物；而丹参酮是临床治疗心、脑血管疾病的重要药物资源，最近的研究还表明丹参酮具有抗癌作用，因此，丹参在临床上具有广泛的应用。然而，丹参可用资源有限及有效成分含量低使之应用受限。丹参毛状根具有生长速度快，不需外源激素及遗传性稳定等优点，为生产丹参酮类活性物质提供了一种良好的培养系统。研究发现，一些生物及非生物诱导子也可以刺激丹参酮合成途径中一些关键酶基因的表达从而提高丹参酮的产量。而随着现代基因工程技术的飞速发展，采用代谢工程策略将丹参酮生物合成途径中的关键酶基因导入到丹参中，获得转基因的发根，并进行大规模的培养，被认为是提高丹参药用活性成分的含量和解决丹参药源问题的最佳途径之一。 在本作品中，我们将丹参酮代谢途径中的关键代谢酶基因HMGR，DXS及GGPPS的cDNA序列分别单独或同时构建于植物表达载体pCAMBIA1304+上的CaMV 35S启动子之后，以发根农杆菌介导的方法遗传转化丹参外植体中获得发根并使转入基因在毛状根中过量表达。结果显示，在H系列（单独转化SmHMGR基因）的丹参毛状根中，其丹参酮产量显著提高。但是在G系列（单独转化SmHMGR基因）的丹参毛状根中，其丹参酮的产量比H系列的丹参毛状根更高。说明在丹参中，GGPPS比HMGR对于丹参酮合成的促进作用更加明显，可能是由于GGPPS比HMGR在丹参酮的代谢途径中更位于下游所致。然而，在HG系列（同时过量表达SmHMGR及SmHMGR）的丹参毛状根中发现一个丹参酮产量最高的株系，HG9。其丹参酮的产量达到了2.727 mg/g DW，比对照组丹参毛状根（0.475 mg/g DW）的丹参酮产量高4.7倍。在本研究中发现丹参酮ⅡA的含量与其丹参毛状根的形态有关，凡是在本研究中丹参酮ⅡA的含量超过0.206mg/g, DW的丹参毛状根都要比丹参酮ⅡA含量较低的丹参毛状根要粗。DPPH自由基清除率试验证明转基因丹参毛状根的总抗氧化活性提高。本研究为利用代谢工程策略大规模商业化生产丹参酮提供了新思路。
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作品专业信息
设计、发明的目的和基本思路、创新点、技术关键和主要技术指标
- 研究目的：利用基因工程技术将丹参酮生物合成途径中的关键酶基因导入到丹参中，研制获得丹参酮高产的转基因丹参发根系，为应用生物技术规模化生产丹参酮类活性成分提供一条新途径。研究思路：将丹参酮生物合成关键酶基因SmDXS，SmHMGR和SmGGPPS分别单独及组合构建到植物表达载体上，遗传转化丹参外植体并获得丹参发根，通过分子检测和含量筛选最终成功获得丹参酮含量明显提高的丹参发根株系。创新点：国际上首次利用基因共转化策略将SmHMGR和SmGGPPS同时导入丹参发根中，成功筛选获得丹参酮产量提高最为显著的发根株系HG9，是丹参酮代谢工程研究的一大突破。技术关键： 1）植物高效表达载体的构建； 2) 丹参酮高产的转基因丹参发根的筛选。主要技术指标： 1）国际上首次利用转基因技术证明了过量表达SmDXS能够显著提高丹参发根中丹参酮的含量,表明DXP途径在丹参酮代谢合成过程占主导作用;同时发现过量表达SmHMGR能够显著提高丹参酮含量, 表明MVA途径在二萜丹参酮代谢合成过程也具有重要作用; 2）国际上首次利用转基因技术证明了过量表达SmGGPPS能够显著提高丹参发根中丹参酮的含量, 暗示GGPPS是调控丹参酮代谢合成的新关键靶点; 3）国际上首次利用基因共转化策略将SmHMGR和SmGGPPS同时导入丹参发根中，结果获得了丹参酮产量提高最为显著的株系, 说明SmHMGR和SmGGPPS相组合则可以产生协同作用。
科学性、先进性
- 作品的科学性： 丹参酮作为临床心脑血管疾病治疗常用中药资源，组合利用基因工程和发根培养技术研制获得丹参酮高产的转基因丹参发根系，对于丹参品质改良、应用范围拓展和解决资源不足等均具有重要意义，同时也为其他中药材的遗传育种和提高活性物质的研究提供可借鉴的研究思路。因而该研究具有重要的科学意义和广阔的应用前景。作品的先进性：这些优质稳定的丹参发根药材原料提供给制药企业生产相关药品, 将带来更为巨大的经济效益; 通过提供高产优质药源在较大程度上降低丹参酮生产成本，使其成为更多的临床患者所使用，会产生巨大的社会效益；利用转基因丹参发根取代丹参野生资源等作为丹参酮的药源，可以在很大程度上遏制对天然野生资源的毁灭性采挖，从而有利于环境保护，并带来巨大的生态效益；该研究有助于提高我国中草药研究的科技含量，推动中药现代化和产业化进程，拉动中药材产业升级，因而该研究具有潜在的应用前景。同时，本项目的实施也为其他名贵中药材的保护和开发利用提供可借鉴的研究思路。
获奖情况及鉴定结果
- 本作品于2010年9月10日，在第四届上海市植物生理学青年学术会议中，经专家评审鉴定后荣获“优秀墙报奖”；2010年10月16日，在上海市遗传学会2010年学术年会暨上海遗传学青年论坛中荣获“复星医药遗传学未来星杯”展板奖。另外，该作品的部分结果已撰写成SCI论文并发表在国际著名杂志Metabolic engineering(IF=4.725)上，本项目组还申请了和本作品相关的专利5项： 1)***，**，**，**，**。双关键酶基因转化提高丹参毛状根丹参酮含量的方法. 中国专利申请号：201010264203.3 2)***，**，**，**，**。转SmGGPPS基因提高丹参毛状根丹参酮含量的方法。中国专利申请号：201010263570.1 3)***，***，**, ***, **，***。SmDXS和SmGGPPS双基因共转化提高丹参酮含量的方法。中国专利申请号：201110034229.3 4)***，**，**，**，**。丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因II及其编码的蛋白质和应用。中国专利申请号：200910045446.5 5)***，**，**，***，***。一种提高水稻种子γ-氨基丁酸含量的方法。中国专利申请号：201010263299.1
作品所处阶段
- 中试阶段
技术转让方式
- 无
作品可展示的形式
- 实物，现场演示，图片
使用说明,技术特点和优势,适应范围,推广前景的技术性说明,市场分析,经济效益预测
- 1.使用说明 按照常规的恒温摇床或生物发酵罐等装置在一定温度条件下（25℃）进行转基因丹参发根的液体大量培养，2个月左右（期间更换新鲜培养液1次）即可获得大批量的丹参酮高产的丹参发根。 2.技术特点本研究获得的丹参发根具有如下特点：1）生长速度快；2）品质稳定性好；3）培养时不需添加外源激素；4）便于工业化大规模生产；5）不受时间和季节的限制。 3. 适应范围，推广前景的技术性说明及市场分析和经济效益预测这些优质稳定的丹参发根药材原料提供给制药企业生产相关药品, 将带来更为巨大的经济效益; 通过提供高产优质药源在较大程度上降低丹参酮生产成本，使其为更多的临床患者所使用，会产生巨大的社会效益；利用转基因丹参发根取代丹参野生资源等作为丹参酮的药源，可以在很大程度上遏制对天然野生资源的毁灭性采挖，从而有利于环境保护，并带来巨大的生态效益；该研究有助于提高我国中草药研究的科技含量，推动中药现代化和产业化进程，拉动中药材产业升级，因而该研究具有潜在的应用前景。
同类课题研究水平概述
- 心、脑血管疾病是威胁人类健康与生命的“头号杀手”。丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)是临床治疗心、脑血管疾病的常用中药(滕艳芬等，2001；郭宝林等，2002；晏琼等，2006)。丹参有效成分主要包括脂溶性丹参酮类成分和水溶性酚酸类成分，其中丹参酮在抗氧化、消炎抑菌及抗肿瘤等方面具有显著疗效，市场需求十分巨大 (梁勇等，2000；Yasuhiro，1997；Kim et al，2003；Gao et al，2008)。不过，野生丹参资源日益减少，栽培丹参品质严重退化、生长周期长及有效成分含量低等原因，致使有限丹参资源与丹参酮巨大市场需求之间供需矛盾日益凸显（郭宝林等，2002；晏琼等，2006；周伟等，2007A)。利用代谢工程策略将关键代谢酶基因遗传转化植物体可以使其相关代谢产物有效提高（Muñoz-Bertomeu et al., 2008；Kai et al., 2009）。因此，利用基因工程技术将丹参酮生物合成途径中的关键酶基因（和/或调控转录因子）导入到丹参中，获得转基因的毛状根系或再生植株，是从根本上提高丹参中丹参酮含量和改良其药材品质的最佳途径之一。目前国内、外有关丹参主要活性成分之一丹参酮的研究主要集中在药理作用、植化分析和毛状根培养等方面(张荫麟等，1995；邱德有等，2004)，国内外尚未见到任何将关键酶基因导入丹参中调控丹参酮代谢合成的研究报道。 从2006年起，申请人所在实验室开始在丹参酮代谢工程方面开展了大量的前期工作，建立优化了丹参毛状根诱导及叶片再生两种遗传转化体系（周伟等2007B），分离克隆了丹参酮产量相关基因HMGS，HMGR，DXS，DXR和GGPPS等（Liao et al，2009；Yan et al，2009；Kai et al，2010）。 本研究将丹参酮生物合成的关键限速酶基因HMGR，DXS，GGPPS及HMGR+GGPPS组合转入丹参，进而考察对次生代谢途径和代谢物产量的影响，最终获得丹参酮含量较原植株明显提高且表达稳定的转基因丹参株系，具有重要的科学意义和广阔的应用前景。
