基本信息
- 项目名称：
- c-myc、Livin基因的表达在内毒素致肝细胞凋亡中的作用及CA的保护效应
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 内毒素（ET)在革兰氏阴性细菌感染发病机理中起着十分重要的作用。尾静脉注射ET建立大鼠内毒素血症模型，并观察多价阳离子A（CA）对其的保护效应，结果显示ET组中各时间段的肝细胞凋亡指数一直上升，CA组的肝细胞凋亡及病理组织学改变较轻；ET可上调c-myc基因和下调Livin基因的表达，从而促进肝细胞凋亡，CA则能明显下调c-myc基因和上调Livin基因的表达，从而抑制肝细胞凋亡。
- 详细介绍：
- 本实验采用流式细胞术、实时荧光定量RT-PCR和免疫组织化学技术研究内毒素(ET)对大鼠肝脏c-myc、Livin基因的表达变化、肝细胞凋亡情况及阳离子A(CA)的保护效应。将72只清洁级SD大鼠随机分为3组：第Ⅰ组为NS对照组(n=24)、第Ⅱ组为ET致病组(n=24)、第Ⅲ组为ET+CA保护组(n=24），三组动物经相应处理后分别在3h、4h、8h、12h采集肝脏作为样本。 本实验通过大鼠注射ET后，经PI染色和流式细胞仪检测，结果表明对照组肝细胞的凋亡率在3h、4h、8h、12h时分别为2.45％、2.71％、3.28％、3.06％；ET组肝细胞凋亡率在3h、4h、8h、12h时分别为10.98％、14.75％、19.23％、24.13％，明显高于各同时期对照组(P<0.01)，且随着时间的增加而增加，这提示了ET能显著促进肝细胞的凋亡。 c-myc基因作为一个参与细胞凋亡调控的主要基因，可激活诱导细胞凋亡通路。本研究实时荧光定量RT-PCR结果显示，对照组和ET组均能检测到荧光信号，方差分析结果表明ET组c-myc基因相对拷贝数极显著高于对照组(P<0.01)。免疫组化结果显示，在对照组和ET组均有c-myc基因的表达，t检验结果表明c-myc基因ET组在肝脏表达均明显高于对照组(P<0.01)。由实验结果可判断，ET组肝脏c-myc基因的表达随时间的增加一直呈上升趋势。本研究结果显示，ET可明显诱导c-myc基因表达的上调，诱导细胞凋亡。 Livin是最近发现的凋亡抑制蛋白家族中的新成员，是一种作用很强的凋亡抑制因子。 本研究实时荧光定量RT-PCR结果显示，对照组和ET组均能检测到荧光信号，方差分析结果表明肝脏ET组Livin基因的相对拷贝数极显著低于对照组(P<0.01)。免疫组化的研究结果显示，在对照组和ET组均有Livin基因的表达，方差分析结果表明Livin基因在ET组肝脏表达均明显低于对照组(P<0.01)。由此可以看出，ET组肝脏Livin基因的表达变化随时间增加呈下降趋势。本实验结果显示，ET能下调Livin基因的表达，使肝细胞凋亡加剧，这是造成肝细胞损伤的机制之一。 Rietschel认为干扰ET结构或干扰含有ET结构的膜的药物都可以帮助杀死细菌。David等在对内毒素拮抗的研究中发现带正电荷的药物是通过其所带正电荷基因与内毒素脂质A上的磷酸基团结合，从而破坏内毒素结构及其生物活性。本实验以CA作为多价阳离子拮抗剂进行内毒素保护作用的研究，CA的保护效应表现在c-myc基因和Livin基因的表达变化上。本实验中用实时荧光定量RT-PCR测定的结果显示，CA保护组肝脏c-myc基因相对拷贝数在8h极显著高于对照组(P<0.01)，3h、4h、12h显著高于对照组(P<0.05)；3h显著低于ET组(P<0.05)；4h、8h、12h极显著低于ET组(P<0.01)。CA保护组肝脏Livin基因相对拷贝数在3h显著低于对照组(P<0.05)，4h、8h、12h 极显著低于对照组(P<0.01)；4h显著高于ET组(P<0.05)，3h、8h、12h极显著高于ET组(P<0.01)。免疫组化实验结果表明，CA保护组c-myc基因表达蛋白3h、4h、8h、12h的积分光密度极显著高于对照组(P<0.01)，极显著低于ET组(P<0.01)。CA保护组Livin基因表达蛋白3h、4h、8h、12h的积分光密度极显著低于对照组(P<0.01)，极显著高于ET组(P<0.01)。由实验结果可知，CA保护组肝脏c-myc基因的表达变化呈先上升后下降的趋势，而Livin基因的表达变化则呈先下降后上升的趋势。如前所述，c-myc是促凋亡基因，Livin是抗凋亡基因，因此，与ET组相比，CA保护组c-myc基因表达的降低和Livin基因表达的升高，必然使肝细胞凋亡受到抑制。其原因是CA下调c-myc基因的表达和上调Livin基因的表达抑制肝细胞的凋亡。通过以上实验结果可以看出，CA对由ET诱导的肝脏损伤有明显的保护效应，这为临床防治内毒素血症和开发抗内毒素药物提供理论依据。
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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 为了探讨内毒素(ET)对肝细胞的损伤机制，本作品采用实时荧光定量RT-PCR、免疫组织化学技术、流式细胞术研究ET对大鼠肝脏c-myc、Livin基因的表达变化，肝细胞凋亡情况及阳离子A(CA)的保护效应。分别在3 h、4 h、8 h、12 h检测各分组肝脏组织细胞凋亡情况、c-myc、Livin基因相对拷贝数及c-myc、Livin基因表达蛋白的积分光密度并观察CA对上述指标的影响。
科学性、先进性及独特之处
- 作品采用实时荧光定量RT-PCR、免疫组织化学技术、流式细胞术等现代分子生物学技术，从分子和细胞水平揭示ET导致c-myc、Livin基因的表达差异变化，肝细胞调亡情况及阳离子A(CA)的保护效应，结果真实且可信度高，对于阐明ET的致病机制，防治内毒素血症具有积极的指导意义和临床应用价值。
应用价值和现实意义
- 阳离子A（CA）能够上调肝脏Livin基因的表达和下调c-myc基因的表达，从而显著地抑制肝细胞的凋亡，对内毒素导致的组织和细胞的损伤有显著的保护效应。在临床上，为内毒素(ET)引起的内毒素血症，在治疗疗效上达到疗效确切、毒副作用小、价格低廉提供了一个较有前景的方向。
学术论文摘要
- 本试验采用流式细胞术，实时荧光定量RT-PCR，免疫组织化学技术研究内毒素(ET)对大鼠肝细胞凋亡情况、肝脏组织中c-myc、Livin基因的表达变化及阳离子A(CA)的保护效应。将72只大鼠随机分为三组，第Ⅰ组为NS对照组(n=24)、第Ⅱ组为ET致病组(n=24)、第Ⅲ组为ET+CA保护组(n=24)，各组经相应处理后分别在3 h、4 h、8 h、12 h检测各组肝脏组织细胞凋亡情况、c-myc、Livin基因相对拷贝数及c-myc、Livin蛋白的积分光密度并观察CA对上述指标的影响。结果显示ET组中各时间段的肝组织中肝细胞凋亡指数一直上升，CA组的肝细胞凋亡及病理组织学改变较轻。在mRNA水平和蛋白水平上，ET组c-myc基因表达量增加但Livin基因表达量下降，而CA组的肝细胞凋亡数较ET组有所减少，c-myc基因表达量减少但Livin基因表达量上升。结论为ET可上调c-myc基因的表达和下调Livin基因的表达，从而促进肝细胞凋亡，最终导致肝细胞损伤。CA则能明显下调c-myc基因的表达和上调Livin基因的表达，从而抑制肝细胞凋亡，对ET诱导的肝损伤具有保护效应。
获奖情况
- 2011年4月获得校级第九届“挑战杯”学生课外学术科技作品竞赛一等奖 2011年5月获得第六届云南高校青年学术科技节自然科学类二等奖
鉴定结果
- 无
参考文献
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同类课题研究水平概述
- 尽管一个多世纪以来学者们对ET进行了深入广泛的研究并取得了瞩目的成绩，但由于ET对机体系统、器官作用的广泛性，至今对内毒素血症的发病机理仍不完全明确，国内疗效确切、毒副作用小、价格低廉的抗内毒素血症疗法也很少。 一百多年来，虽然阐明了ET 的化学本质结构，深入研究了ET与机体的相互作用，对内毒素性疾病尤其是内毒素性休克的发生机理也有了许多深入广泛的认识，但是由于内毒素休克发生机理的复杂性，导致临床上对内毒素性休克及由此引起的多器官功能衰竭的治疗效果依然不如人意，内毒素休克的病死率仍居高不下。这说明内毒素休克发生机理亟待更深入的研究。特别是研究凋亡在内毒素体外介导细胞损伤的影响，有利于更深入全面的阐明内毒素诱发的疾病机制。近年来，国内主要从事ET致细胞凋亡方面的研究有：河北省医学科学院药物研究室的李丽萍等，对关于氨基胍在内毒素性肺损伤中起何作用作了研究；复旦大学公共卫生学院的周晓瑜等关于内毒素在小鼠过敏性哮喘模型所起的作用进行了探讨；浙江杭州市中医院的郑文龙等对慢性阻塞性肺疾病血瘀症与内毒素、内皮素的关系进行了研究探讨；华中科技大学同济医学院的祝伟等就己酮可可碱在内毒素血症大鼠模型中心肌HSP70和NF-κB表达中有何影响做了探讨研究；华中科技大学同济医学院的李敬等采用脂多醣致小鼠死亡实验研究板蓝根的抗内毒素作用。机体的细胞凋亡系统极其复杂，各调节凋亡基因更多的是通过不同的凋亡途径来共同调节细胞的凋亡。c-myc和Livin是目前研究较为深入的两种凋亡相关基因。近来发现c-myc基因与细胞凋亡有密切关系，实验证明，c-myc与TNF诱导的凋亡过程可因Bcl-2蛋白的异位表达而受到限制，Bcl-2能阻止由c-myc基因引起的细胞凋亡，Bcl-2的相伴活动能取消c-myc对细胞凋亡的影响等等。但是内毒素对肝脏细胞凋亡过程中c-myc基因和Livin基因的表达变化及它们之间相互作用影响对肝细胞凋亡有何表达变化，目前尚未弄清楚。
