基本信息
- 项目名称：
- 蛇血清磷脂酶A2 抑制剂的抗炎症作用初探
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 在人体中，PLA2是整个炎症通路的总开关，其过度表达导致下游炎症介质的大量释放，进而导致了临床上的炎症性疾病。从源头上抑制PLA2的过度表达是防止此类炎症性疾病的重要思路。于是我们根据“酶-抑制剂”的关系以及自然界中的解毒关系，结合生物信息学和分子结构拟合，分析了PLA2活性中心，最终筛选到了天然特异性PLA2抑制剂，并且得到了具有活性的多肽序列，为后续的药物研究打下了基础。
- 详细介绍：
- 分泌型磷脂酶A2（sPLA2）是人体代谢网络中非常重要的一种酶，它是花生四烯酸炎症信号通路的“总开关”。sPLA2 的过度表达或过早激活是重症急性胰腺炎、急性缺血性脑损伤、冠心病、肿瘤等多种疾病的重要原因。针对这个通路，目前临床药物主要有两类：一类为花生四烯酸分解酶COX 抑制剂，另一类是sPLA2 非特异性抑制药物，两类药物共有特点是副作用较大。因此，寻找高特异性、低副作用的sPLA2抑制剂，是亟待解决的问题。自然界，蛇毒中的sPLA2 含量最为丰富，且为其主要的毒性成分，而一些蛇血清具有中和蛇毒毒性的作用。因此，蛇血清是sPLA2 抑制剂的重要来源。通过生物信息学，对蛇毒sPLA2 活性中心进行了研究，并对人源和蛇源sPLA2 进行了一级序列比对。采用Swiss-model 同源建模方法预测各种sPLA2 的三级结构，并用UCSF Chimera 软件对两种来源sPLA2 的三级结构进行了比对。结果发现人源和蛇源sPLA2 一级结构相似度为35%-49%，三级结构相似度超过95%。这表明，蛇血清sPLA2 抑制剂极可能对人sPLA2 有抑制作用，这充分展现出了其广泛的临床应用前景。在生物信息学研究基础上，我们对蛇血清PLI（Phospholipase A2 Inhibitor）进行了筛选与纯化。利用Source 30Q 层析柱，从五步蛇蛇毒中分离得到一个中性sPLA2，活性测定表明其具有强烈的sPLA2 酶活性和出血毒性。以该sPLA2 为靶酶，对某省常见六种蛇（华游蛇、王锦蛇、颈棱蛇、金环蛇、银环蛇、眼镜蛇）血清进行了筛选。初筛结果表明：颈棱蛇和华游蛇血清sPLA2 抑制活性最高。基于初筛结果和资源量，确定以华游蛇血清为原料，分离纯化sPLA2抑制剂。通过Source 30Q、超滤、Uno Q 柱精纯化等三个步骤，从华游蛇血清中纯化得到一个PLI，SDS-PAGE 表明该蛋白含有25.4Ku 和21.2Ku 两个亚基，初步推测该蛋白为γ 型PLI。另经实验证明其对于人GIIPLA2 也有良好抑制活性，且抑制效果显著优于氯喹。基于各种 PLI 序列和文献，通过生物信息学研究，发现PLI 是以β-转角为特征的、含有芳香族氨基酸或类似苯环的结构，主要与sPLA2疏水性通道结合而发挥抑制作用。我们筛选了各PLI 的核心活性序列，得到一个活性短肽，经分子对接软件处理预测该短肽正好镶嵌于sPLA2 输水通道中。据此我们设计并合成一个含有19 个氨基酸的模拟肽，其序列为PGLPLSLQNGGGGSVAFRS，并在分子水平及细胞水平验证了其抑制活性。通过上述生物信息学理论预测和有关实验，结果表明蛇血清PLI 对人sPLA2 具有良好的抑制活性，有望开发成为临床抗花生四烯酸炎症通路药物。本研究设计合成的19aa PLI 模拟肽，为临床小分子抗炎药物开发提供了新的思路。
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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 本作品希望在自然界找到一种高特异性、低副作用抗炎药物PLI。PLA2是炎症通路总开关，而蛇毒PLA2是毒蛇捕猎武器，蛇血清解毒蛋白PLI使其不惧毒液。经生物信息学分析发现蛇毒与人PLA2高度相似，说明蛇血清PLI对人PLA2的抑制作用。本实验从五步蛇毒中纯化PLA2，以此为靶酶进行PLI筛选，最终从华游蛇血清中纯化到一种PLI。此外我们设计一个具有抑制活性的19肽，也成为特异性抗炎药物另一突破点。
科学性、先进性及独特之处
- 科学先进性：1.PLA2是人体炎症通路总开关，PLI可有效抑制炎症发生和继发展；2.基于生物信息学，蛇和人PLA2结构高度相似。为PLI用于抑制人PLA2提供科学依据，同时在实验中得到验证；3.PLI特异性的靶点，降低了其副作用；4.根据PLI序列设计的模拟肽，可解决蛋白药物免疫原性缺点。独特之处：根据“酶-抑制剂”关系，结合生物信息学筛选到天然特异性PLI及模拟肽序列，为后续药物研究打下基础。
应用价值和现实意义
- 1. PLI可以应用到临床各种急慢性炎症预防和治疗，例如急性胰腺炎，具有毒副作用小，特异性强的特点。2. PLA2广泛存在各种蛇毒中，是主要毒素成分。因此，蛇血清PLI可以广谱地治疗蛇咬伤，即PLI可被开发成广谱型抗蛇伤药物。相对抗蛇毒血清，PLI更安全、易保存，且不需辨认为何种蛇咬伤，因此开发价值较大。而抗蛇毒血清不易制备和保存，应用时必须知道毒蛇种类，还具有免疫原性，这对偏远山区人们意义不大。
学术论文摘要
- PLA2是炎症通路总开关。PLA2的过度表达是多种炎症性疾病的重要原因。目前临床抗炎药物副作用大。因此，寻找高效低副作用的PLA2抑制剂是亟待解决的问题。蛇毒中PLA2含量最丰富，为其主要的毒性成分，而一些蛇血清中含有PLI能中和蛇毒PLA2。本文第一部分利用生物信息学，对人源和蛇源PLA2进行了序列比对，发现人源和蛇源sPLA2一级结构相似度为35%-49%，三级结构相似度超过95%。随后我们利用层析柱，从五步蛇蛇毒中分离得到sPLA2，活性测定其酶活性和出血毒性最强。以其为靶酶，对某省常见六种蛇血清进行初筛，结果表明华游蛇抑制活性最高。通过Source 30Q、超滤、Uno Q从华游蛇血清中纯化得到PLI，SDS-PAGE 表明该蛋白含有25.4Ku 和21.2Ku 两个亚基，初步推测该蛋白为γ型PLI。并证明了其对于人GIIPLA2 的抑制活性。第三部分中，通过筛选各PLI的活性序列设计并合成一个19aa模拟肽，并验证了其抑制活性。上述生物信息学和实验表明PLI对人PLA2 具有良好的抑制活性，有望开发成为临床抗炎药物。模拟肽为临床小分子抗炎药物开发提供了新的思路。
获奖情况
- 1.Priminary investigation to the clinical applicatioin of phospholipasae A2 inhibitor from serum[J].Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology,2010,107.(指导老师为通讯作者） 2.Snake venom C-type Lectin protein, agacuterin,inhibits platelet aggregation and carcinoma cell migration[J].Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology, 2010,107.(指导老师为通讯作者） 3.From global to individual: the discovery of a novel C-type lectin protein from five-pace snake venom[J].Cell Biology International,2010,34. 4.蛇毒C 型凝集素家族结构及抗原表位预测[J].中国免疫学杂志,2010,26:963. 5.蛇血清分泌型磷脂酶A2抑制剂防治人炎症的生物信息学分析[J].基础医学与临床,2011.（5月份接收，排版待刊登） 6.常见蛇血清中抗蛇毒sPLA2蛋白的筛选与纯化[J].药物生物技术,2011.（5月份接收，排版待刊登）
鉴定结果
- 合格
参考文献
- 1.黄松, 黄接棠.王锦蛇血清对尖吻蝮蛇毒的抑制作用[J].蛇志,2005,179:237. 2.胡恺, 万新华等.乌梢蛇血清对白眉蝮等3种蛇毒解毒作用初探[J].蛇志,2006,18:178. 3.Ichiro K, Makoto M.PLA2 enzymes[J].Prostaglandins & other Lipid Mediators,2002,68:3. 4.罗艳萍, 陈远志.短尾蝮蛇毒磷脂酶A2的分离纯化及抗血小板聚集作用[J].蛇志,2009,21:90. 5.Xu S, Chen C,et al.Crucial role of groupⅡPLA2 in pancreatitis-associated adrenal injury in acute necrotizing pancreatitis[J].Pathology-Research and Practice,2010,206:73. 6.Maria EG, Ofelia CA,et al. Isolation and functional characterization of a new acidic PLA2 Ba-SpII-RP4 of the Bothrops alternatus snake venom[J].Toxicon,2010,56:64. 7.Kohshi K, Ryoichi S,et al.Up-regulation of the expressions of PLA2 inhibitors in the liver of a venomous snake by its own venom PLA2[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2010, 395:377. 8.周长虹，梁宁生.磷脂酶A2抑制剂与相关疾病的研究进展[J].中国药房,2009,20:378. 9.Ryoichi S, Michihisa T,et al.Identification and characterization of PLA2 inhibitors from the serum of the Japanese rat snake[J].Toxicon,2009,53:685.
同类课题研究水平概述
- 从蛇血清这一角度进行的sPLA2 抑制剂研究，国内外已有一些报道。国内目前采用的方法还主要是单纯的用某种蛇血清中和蛇毒的表观实验法，发现了某种蛇血清有一定的中和疗效，或者分离得到PLI，没有深入研究。目前在国内相关领域研究中，黄松利用王锦蛇血清作用于尖吻蝮蛇蛇毒，发现王锦蛇血清对尖吻蝮蛇蛇毒引起的组织损伤及炎症有抑制、保护和治疗作用。国际上，Ikuo N 等利用融合蛋白技术对TfPLI 抑制Tf sPLA2 机理研究发现，失去完整N 端(1-37aa)的TfPLI 不具有活性。peter G 从 Naja ater 蛇血清从提取得到的NaPLI，对源于类风湿病患者关节滑液中的sPLA2 具有较强抑制活性。这一发现提示，蛇血清PLI 可用于治疗临床上sPLA2 介导的炎症反应。Thwin 设计出2 种短肽，与sPLA2 的疏水通道结合发挥其抑制活性；Chandra 等人也合成2 种五肽LAIYS、 FLSYK，具有一定sPLA2 亲和力。总的来说，目前国内已有的研究报道对于蛇血清中sPLA2 抑制剂运用的技术较为单一，只是发现了某种蛇血清有一定的疗效，对于具体的成分及活性没有深入的研究；国际上，仅仅停留于PLI 的分离纯化及活性检测，而对于PLI 与sPLA2的具体作用机制研究的较少，获得的成果亦不多。在国外，对于PLI 的研究已经受到了科研机构的重视，据统计，现在已经从21 中蛇血清中分离得到PLI，根据其结构和作用机制不同分为α、β、γ 三类。本文相比较国内外蛇血清PLI 的研究，有以下几点进展：1、综合分析确定蛇毒中PLA2 为sPLA2,这对后续深入研究奠定了基础；2、分离纯化蛇血清蛋白得到了γ 型PLI，并将其作用于sPLA2；3、采用生物信息学方法，提取了PLI，并对其临床应用进行了研究。蛇血清PLI 的分离纯化及机制研究为高效低毒的抗蛇毒药物研究提供了新的方向，同时也为特异性干预人sPLA2 炎性通路的临床药物的研究带来了希望。本论文所设计思路及研究技术在蛇血清PLI 这一研究领域中，已处于较前沿，达到了“国内领先，国际先进”的水平。
