基本信息
- 项目名称：
- 人骨形态发生蛋白4成熟肽序列在毕赤酵母中的高效表达、纯化和活性检测
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 根据毕赤酵母高表达基因对特定密码子偏好的特性，选择毕赤酵母高表达基因偏好的密码子，替换人BMP-4成熟肽序列在毕赤酵母高表达基因中不常用的密码子，优化设计人BMP-4成熟肽表达序列并构建重组表达载体；转化毕赤酵母宿主菌和筛选高表达菌株；利用色谱纯化技术设计纯化路线，纯化重组人BMP-4；对纯化的重组蛋白进行生理活性检测。
- 详细介绍：
- 目的：骨形态发生蛋白4（Bone morphogenetic protein 4，BMP4）是一种生长因子，具有明显促进细胞组织分化为骨组织的能力，在骨缺损、骨折的修复和脊柱融合等众多方面的骨科临床上有很高的应用价值。从哺乳动物骨骼材料中提取的天然BMP-4数量有限、成本高、且具有免疫源性，限制了其在临床上的应用。为此，我们建立了人BMP-4在毕赤酵母中的高效表达及纯化工艺。 方法：根据毕赤酵母高表达基因对特定密码子偏好的特性，选择毕赤酵母高表达基因偏好的密码子，替换人BMP-4成熟肽序列在毕赤酵母高表达基因中不常用的密码子，优化设计人BMP-4成熟肽表达序列并构建重组表达载体；转化毕赤酵母宿主菌和筛选高表达菌株；利用色谱纯化技术设计纯化路线，纯化重组人BMP-4；对纯化的重组蛋白进行生理活性检测。 结果：控制表达序列A+T含量在30-55%的范围内，尽可能使用毕赤酵母高表达基因偏好的密码子，优化设计人BMP-4表达序列，使人BMP-4的表达水平提高了4倍，在摇瓶表达中产量能达到48mg/L。发酵上清中的重组人BMP-4用SP Sepharose和heparin亲和色谱层析法进行纯化。对纯化后的人BMP-4进行生理活性的检测，结果显示重组人BMP-4能异位诱导软骨细胞的生成和增加效应细胞的碱性磷酸酶的活性，具有生理活性。 结论：通过对人BMP-4表达序列的优化设计，有效地解决了人BMP-4在毕赤酵母中表达量低的问题，同时建立了重组人BMP4纯化工艺，并证明毕赤酵母系统表达的人重组BMP-4具有明显的生理活性，为人BMP-4进一步的临床应用开发奠定了良好的基础。
作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 天然提取的BMP-4数量有限、成本高、且具有免疫源性，限制了其在临床上的应用。为此，我们建立了人BMP-4在毕赤酵母中的高效表达及纯化工艺。选择毕赤酵母高表达基因偏好的密码子，替换人BMP-4成熟肽序列在毕赤酵母高表达基因中不常用的密码子，优化设计人BMP-4成熟肽表达序列并构建重组表达载体；转化毕赤酵母宿主菌和筛选高表达菌株；纯化重组人BMP-4；对纯化的重组蛋白进行生理活性测。
科学性、先进性及独特之处
- 利用毕赤酵母使用的高频密码子替换hBMP-4成熟肽序列中的低频密码子并控制其序列的A+T含量在30-55%水平，人工设计一条hBMP-4成熟肽优化序列。优化序列通过人工合成并在毕赤酵母中实现高效表达。与原序列相比，密码子优化后序列使hBMP-4的表达产量提高了4倍，通过色谱法纯化hBMP-4，建立了纯化工艺。而纯化后hBMP-4显示出可诱导软骨细胞的形成和增加碱性磷酸酶的生物活性。
应用价值和现实意义
- BMPs是一类广谱性的蛋白质生长调节因子，在临床医学有很好应用前景。但是天然提取的BMPs产量低，费用高，无法很好的应用在临床医学上。本研究通过优化密码子的手段，使hBMP-4在毕赤酵母中表达产量提高了4倍，且通过色谱层析法纯化得到BMP-4并对纯化后的hBMP-4的生理活性进行鉴定，从而得到高表达，纯化的，有活性的BMP-4。为进一步开展临床应用的研究和将来可能的临床应用奠定了研究基础。
学术论文摘要
- 在最初的表达研究中，我们将原始的hBMP-4成熟肽序列在毕赤酵母中表达。尽管hBMP-4在非常强的酵母启动子AOX1控制下表达，但其在摇瓶培养中表达量较低。为了提高hBMP-4的表达水平，我们利用酵母高表达基因使用的高频密码子替换了hBMP-4原序列中低频密码子，设计一条表达序列。该序列只含有酵母偏好的密码子，同时A+T含量被控制在30-55%的范围内。密码子优化后使hBMP-4的表达水平提高了4倍，在摇瓶表达中产量达到48mg/L。发酵上清中的重组hBMP-4用SP Sepharose和heparin亲和色谱层析法进行纯化。对纯化后的rhBMP-4进行生理活性的检测，结果显示rhBMP-4能诱导异位软骨细胞的产生和增加效应细胞的碱性磷酸酶的活性。
获奖情况
- 无
鉴定结果
- 无
参考文献
- [1] Shore EM, Xu M, Shah PB, Janoff HB, Hahn GV, Deardorff MA, Sovinsky L, Spinner NB, Zasloff MA, Wozney JM, Kaplan FS. The human bone morphogenetic protein 4 (BMP-4) gene: molecular structure and transcriptional regulation. Calcif Tissue Int 63(3): 221-229.1998. [2] Selever J, Liu W, Lu MF, Behringer RR, Martin JF.Bmp4 in limb bud mesoderm regulates digit pattern by controlling AER development. Dev Biol 15;276(2): 268-279. 2004. [3] Hosoya A, Kim JY, Cho SW, Jung HS. BMP4 signaling regulates formation of Hertwig's epithelial root sheath during tooth root development. Cell Tissue Res 333(3) :503-509. 2008. [4] Cregg JM, Cereghino JL, Shi J, Higgins DR. Recombinant protein expression in Pichia pastoris. Mol Biotechnol 16(1) :23-52. 2000. [5] Cereghino GP, Cereghino JL, Ilgen C, Cregg JM. Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris. Curr Opin Biotechnol 13(4): 329-332. 2002.
同类课题研究水平概述
- 骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Proteins，BMPs)，是一类广谱性的蛋白质生长调节因子，其全长cDNA约为1.2 kb，转录、翻译后具有生理活性的分子是一类磷酸化的二聚体糖蛋白多肽分子。已有的研究表明BMPs不仅对器官的发育起关键的作用，而且对骨质的生长、神经细胞的再生、创口愈合以及神经肿瘤的治疗等均有明显的促进功能。 国内研究机构多利用原核系统表达BMPs 。利用原核系统表达的BMPs要经过烦琐的变性和复性过程。对于结构较复杂BMPs分子(有六个链内二硫键和一个链间二硫键)，复性的成功率很低，并且原核系统无法使表达的BMPs进行糖基化加工，因此利用原核系统表达的BMPs在生理活性上必将受到影响。国外研究机构则利用哺乳动物细胞系统表达BMPs。哺乳动物细胞系统能表达出高活性的天然构象BMPs，但其表达量低，需要昂贵的设备和培养基，使得利用哺乳动物细胞系统表达的BMPs成本很高。 为了避免以上两种表达系统对hBMP-4表达的影响，本课题选用了毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统。毕赤酵母(Pichia pastoris)是单细胞真核生物，它既有原核生物生长快、培养容易、表达量高等优点，同时，因其是真核生物，又能对表达的重组蛋白进行翻译后加工和修饰，使表达的外源蛋白具有较高的生物学活性，因此，非常适合真核蛋白的表达。2000年之前已有400多种外源蛋白在毕赤酵母中成功表达，2002年以后，在Pichia pastoris中表达的外源蛋白又增加了40多种。 毕赤酵母表达系统虽然具有以上的许多优点，但也存在着一些缺陷。其中之一是由于物种间对密码子偏好的不同造成有些外源蛋白在毕赤酵母中表达量过低。为了提高hBMP-4的表达量，本课题对hBMP-4序列进行优化，研究其对hBMP-4在毕赤酵母中表达水平的影响。我们的研究结果也为其它外源蛋白在毕赤酵母中的表达提供借鉴。
