基本信息
- 项目名称：
- 温敏β-环糊精衍生物用于蛋白质复性的研究
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”作品
- 小类：
- 能源化工
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 用温敏化合物聚N-异丙基丙烯酰胺（PNIPA-COOH）改性β-环糊精，考察改性产物对变性溶菌酶的复性效率及复性机理。结果表明：改性产物对盐酸胍变性溶菌酶的复性具有抑制作用，但对尿素变性溶菌酶的复性具有促进作用；荧光光谱实验证实改性产物分子中的环糊精空腔与PNIPA链段可以同时促进溶菌酶的复性。
- 详细介绍：
- 环糊精和温敏聚合物聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPA)对蛋白质的复性均有良好的促进作用。本研究将氨基-β-环糊精（EDA-β-CD）和带末端羧基的聚N-异丙基丙烯酰胺（PNIPA-COOH）偶联得到了一种温敏β-环糊精衍生物(β-CD-PNIPA)，分别考察其在不同变性体系、不同β-CD-PNIPA浓度、不同复性温度以及在表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）存在下对溶菌酶的复性效果；通过与EDA-β-CD和PNIPA-COOH的对比分析，揭示了β-CD-PNIPA分子中的环糊精空腔与PNIPA链段的协同作用，并使用荧光光谱法进行了验证。实验结果表明：β-CD-PNIPA对盐酸胍变性溶菌酶的复性具有抑制作用，但对尿素变性溶菌酶的复性具有促进作用；在常温下，0.4mg/mL的β-CD-PNIPA可使1 mg/mL溶菌酶的复性率增加至83.7%，而直接稀释法仅为55.8%；β-CD-PNIPA对溶菌酶的复性温度应略小于β-CD-PNIPA的相转变温度（LCST，33.6℃），高于这一温度时会由于β-CD-PNIPA发生相变而导致溶菌酶的复性率急剧降低。在辅助溶菌酶复性的过程中，β-CD-PNIPA分子中的环糊精空腔与PNIPA链段可以同时促进溶菌酶的复性，荧光光谱实验结果证实了这一结论。
作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 目的：探索温度敏感型环糊精对天然蛋白质（溶菌酶）的复性效率及复性机理。思路：将经过温敏化合物聚(N-异丙基丙烯酰胺)改性后的β-环糊精用于溶菌酶的复性，通过比较本研究中制备的EDA-CD、PNIPA-COOH和β-CD-PNIPA对于溶菌酶复性的影响考察β-CD-PNIPA单独用于溶菌酶复性的可能性，并采用荧光光谱法研究了β-CD-PNIPA与溶菌酶的相互作用机理。
科学性、先进性及独特之处
- 1.将具有环境响应型的β-环糊精单独作为人工分子伴侣直接辅助用于溶菌酶的复性，这是以往的研究较少涉足的。 2.将三种不同类型的β-环糊精与表面活性剂组成人工分子伴侣系统，探讨在溶菌酶的复性过程中二者的协同作用。 3.采用圆二色谱法及荧光光谱法研究溶菌酶的复性过程，探讨在复性过程中β-环糊精的存在对蛋白质的二级结构的影响，并分析溶菌酶的复性动力学过程，探索其折叠机理。
应用价值和现实意义
- 本作品着眼于当前生物化学领域的热点——蛋白质复性中存在的一些问题，合成了一种新型的功能型的环糊精衍生物用于变性蛋白质的复性，在一定程度上解决了在传统蛋白质复性研究中复性收率普遍较低以及复性完成后复性剂与蛋白质的分离问题。从研究结果来看，达到了研究者的设计要求，具有较高的实际应用和推广价值。
学术论文摘要
- 用温敏化合物聚N-异丙基丙烯酰胺（PNIPA-COOH）改性β-环糊精，通过评估β-CD-PNIPA、EDA-CD和PNIPA-COOH对经尿素变性的溶菌酶的复性效果，从而证实是否可将β-CD-PNIPA单独用于辅助蛋白质复性。结果显示，加入EDA-CD、PNIPA-COOH或β-CD-PNIPA后，溶菌酶复性率均高于直接稀释时溶菌酶的复性率。特别地，单独加入β-CD-PNIPA时溶菌酶的复性率最高，但略低于将β-CD-PNIPA和CTAB按最佳顺序加入到复性液中时。最好在低于β-CD-PNIPA的Lower critical solution temperature（LCST）的温度条件下将β-CD-PNIPA用于辅助蛋白质复性。β-CD-PNIPA与溶菌酶的相互作用是通过荧光发射光谱表征的。基于以上结果，β-CD-PNIPA可单独用于辅助蛋白质复性，也可与CTAB联合用于辅助蛋白质复性。加入β-CD-PNIPA后溶菌酶的复性得到了改进，这是因为β-CD空穴对溶菌酶分子具有包络作用以及溶菌酶分子与PNIPA片段间存在疏水作用。
获奖情况
- 我校课外学术科技节一等奖 我省青年学术科技节一等奖
鉴定结果
- 无
参考文献
- （1）β-环糊精的温敏改性技术检索文献：T. Nozaki, Y. Maeda, K. Ito, H. Kitano, Cyclodextrins Modified with Polymer Chains Which Are Responsive to External Stimuli, Macromolecules, 1996, 285: 22-524. （2）溶菌酶变性技术检索文献：A. Desai, C. Lee, L. Sharma, A. Sharma, Lysozyme renaturation with cyclodextrins: structure– activity relationship, Biochimie, 2006, 88: 1435–1445. （3）溶菌酶活性的测定技术检索文献：P. Jolles, Preparation and assay of enzymes. Meth. Enzymol, 1962, 5: 12–13.
同类课题研究水平概述
- 由于环糊精分子中含有疏水性空腔，客体分子能从宽口端进入其分子空腔形成包络化合物。因此在使用表面活性剂辅助蛋白质复性时，常常需要加入环糊精以剥离与蛋白质形成胶束的表面活性剂或去污剂。Karuppiah等人发现，向盐酸胍变性的碳酸脱水酶(CAB)复性稀释液中加入适量β-环糊精(β-CD)可使其复性率超过90%。他们认为这是由于环糊精的疏水性空腔与蛋白质复性中间体的疏水性位点发生了相互作用。聚(N-异丙基丙烯酰胺) (PNIPA )是一种具有温度敏感性的聚合物，其相转变温度(Lower critical solution temperature，LCST)在32 ℃附近。Lin等人曾将PNIPA用于辅助β-lactamase的复性，发现其复性效率比PEG更高，使用PNIPA可使经盐酸胍变性的β-lactamase的活性率提高41％，而PEG只能提高26％。Lu等人曾采用SDS–PAGE, 圆二色谱和荧光光谱等方法研究了PNIPA对尿素变性溶菌酶的复性机理，认为PNIPA对溶菌酶的复性作用是因为PNIPA增强了蛋白质的二级结构并抑制了溶菌酶的聚集作用，从而促进蛋白质的复性。将β-CD与PNIPA耦联，制备具有温度敏感的β-环糊精衍生物(β-CD-PNIPA)主要被用于药物释放系统的研究。虽然Lu等人曾将该体系用于溶菌酶的复性，但偶联产物中的β-CD结构单元主要用于剥离表面活性剂CTAB，而未考察其对溶菌酶的复性作用。结合Karuppiah等人的研究，我们认为，β-CD-PNIPA用于辅助蛋白质复性时，其分子中PNIPA链段及环糊精的疏水性空腔应当可以同时促进溶菌酶的复性，即具有协同辅助蛋白质复性的作用。
