基本信息
- 项目名称：
- 用于质粒筛选的新型荧光载体构建
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 利用绿色荧光蛋白作为报告基因，构建一种新型的质粒载体，可以通过激发光照射后有无荧光产生进行高效的重组质粒筛选，建立了一种快捷可靠、低假阳假阴性、高通量的细菌重组质粒筛选方法。这种融合荧光蛋白基因的新型质粒载体构建，不仅可以拓展绿色荧光蛋白的应用范围，而且为筛选细菌重组质粒克隆提供新的技术方案。
- 详细介绍：
- 摘 要 本研究主要内容是构建一种以绿色荧光蛋白（GFP）为报告基因的新型载体。实验用EcoRⅠ、NdeⅠ两种酶对PUC19质粒和GFP基因进行双酶切，将PUC19质粒上的原报告基因LacZ片段切下后连入GFP基因，形成以绿色荧光蛋白为报告基因的新型质粒载体pGreenYU。新载体转入到大肠杆菌DH5α，摇菌后发现菌液呈现出明显的荧光。提取菌液中的质粒载体进行酶切及PCR鉴定，结果证明，新型荧光载体pGreenYU构建成功。 关键词：绿色荧光蛋白（GFP）；新型载体； pGreenYU ；构建 目 录 1 前言 1 1.1 GFP简介 1 1.2质粒筛选的一般方法 2 1.3本研究的意义 3 2 材料与方法 3 2.1材料 3 2.1.1 菌株 3 2.1.2 试剂 4 2.1.3 主要仪器 4 2.2方法 4 2.2.1 GFP基因的克隆 4 2.2.2 构建融合GFP基因的重组质粒pGreenYU 7 2.2.3对融合有GFP基因的重组质粒pGreenYU进行鉴定 10 3 结果与分析 12 3.1 GFP基因的克隆 12 3.2 PUC19质粒酶切 12 3.3重组质粒pGreenYU转化后平板培养和菌液离心后的结果 13 3.4重组质粒pGreenYU的双酶切和PCR扩增鉴定 14 4 讨论 15 4.1 重组质粒pGreenYU的优点 15 4.2 重组质粒pGreenYU的缺点 16 4.3 荧光法和蓝白斑法的筛选效率 16 4.4 研究展望 17 参考文献 19 1 前言 1.1 GFP简介 绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)是海洋中无脊椎刺胞动物体中的一种天然蛋白。最早由Osamu Shimomura【1】于1962年在水母（Aequorea victoria）中发现。它由238个氨基酸残基组成，序列中的65-67位残基（Ser65-Tyr66-Gly67）可自发形成荧光发色基团——对羟基苯咪唑啉酮。GFP的化学性质相当稳定，无光漂白现象，用甲醛固定和石蜡包埋亦不影响其荧光性质。在细胞生物学与分子生物学领域中，绿色荧光蛋白基因常被用作报告基因【2-4】。目前GFP的应用主要包括以下几个部分： （1）作为分子标记：GFP作为一种新型，高效的报告基因，已经在生物研究中得到了广泛的应用，利用绿色荧光蛋白独特的发光机制，可将GFP作为蛋白质标签将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染适合的细胞进行表达，然后利用荧光显微镜便可以对标记的蛋白质进行细致，仔细的观察研究。Casper【5】将gfpcDNA插入到的TMr基因组cDNA克隆中，导入烟草植株，在植株的局部组织（感染的叶子）和系统组织（整个植株）中，都观察到了病毒的感染和GFP基因的表达。 （2）筛选新的药物：由于GFP对细胞生长以及细胞的功能影响很小，而且它有很多种颜色不同的变种，可以同时使用不同颜色的GFP衍生物标记相关的蛋白质，来观察单细胞内相互作用的靶蛋白，再利用荧光激活细胞分离器等分理处目的细胞，从而大大扩大了筛选新药物的规模。章涛等【6】成功建立重组质粒phPPAKα一IRES2一EGFP高效体外转染表达体系，为hPPAKd受体功能的研究及基于hPPARd为靶标的药物筛选平台的建立奠定了基础。 （3）在基因治疗中的应用：将GFP放入到逆转录病毒载体中作为标记，使其在哺乳动物细胞内表达，可直接经流式细胞仪进行快速分离转染细胞，效果比一般的传统方法要又有效得多。杨简等【7】成功地将Lenti-GFP转染至球囊损伤的大鼠颈动脉，并能维持目的基因稳定长期的表达。Lenti-GFP是血管再狭窄基因治疗的理想载体。 （4） GFP基因作为免疫标记物：利用GFP的发光特性使免疫反应呈绿色荧光从而可以直接观察,可望取代传统的标记技术,建立特异、灵敏、简便和快速的免疫诊断新方法。岳莉莉【8】等成功地实现了gfp与HBVe抗原基因融合后在大肠杆菌和昆虫细胞中高效表达,得到既能发射荧光又具有抗原性的双功能融合蛋白,为获得一种新型发光免疫诊断试剂奠定了基础。 （5）用GFP来构建重组质粒：由于GFP分子量较小,仅为27~30kD,编码GFP的基因序列也很短,为2.6kb,所以很方便地同其它序列一起构建多种质粒,而不至于使质粒过大影响转化频率【9】。 1.2质粒筛选的一般方法 在近几年的基因工程技术研究过程中，常用的重组质粒细菌和空质粒细菌的筛选方法有蓝白斑筛选法、质粒快检法、菌落PCR、菌落原位杂交、插入失活、限制性内切酶酶切反应等等。常见报告/ 标记基因有β_半乳糖苷酶基因( lacZ ) 、荧光素酶基因( lux ) 、β_葡萄糖苷酶基因( GUSA) 、CAT 和几种常用抗菌素基因。基因工程技术操作中最经典的质粒筛选方法是利用标记基因lacZ进行蓝白斑筛选，这是一种酶促催化反应，需要加入外源底物和诱导物(如IPTG,X-gal)，这种方法能够有效地起到筛选重组体的作用，但是也存在一些缺点，比如操作繁琐、外源底物和诱导物价格昂贵、使用范围窄、假阳性率高等。 1.3本研究的意义 GFP分子质量小，能够在异源细胞中稳定表达，并发射荧光，不需要任何辅助因子参加，对细胞没有毒性，这些特点都使之非常适合构建基因工程载体。与lacZ相比，GFP分子很小，仅为27KD，它主要以单体形式发挥功能；而lacZ就大得多，达135KD，并且以四聚体形式发挥功能。因此，GFP作为报告基因从本质上更适合用作融合蛋白。 结合GFP独特的优良性质和目前重组质粒筛选的现状，我们研究了利用绿色荧光蛋白作为报告基因，构建一种新型的质粒载体，不需要外源底物和诱导物，从而替代蓝白斑筛选，建立以绿白斑筛选方法筛选阳性重组子的新方法，更简单、高效、快捷、可靠。 这种融合了绿色荧光蛋白基因的新型质粒载体的构建，不仅可以拓展绿色荧光蛋白的应用范围，而且为筛选细菌重组质粒克隆提供新的技术方案。 2 材料与方法 2.1材料 2.1.1 菌株 E.coli DH5α 2.1.2 试剂 PCR试剂盒，DNA纯化回收试剂盒，质粒纯化回收试剂盒，DNA Marker、限制性内切酶购自TaKaRa公司；EcoRⅠ，NdeⅠ，T4 DNA聚合酶， PET-28a-GFP由浙江省生命科学学科竞赛主委会提供，其余试剂均为进口或国产分析纯。 2.1.3 主要仪器 PCR仪（德国Eppendorf），离心机（德国Eppendorf），凝胶成像系统 2.2方法 2.2.1 GFP基因的克隆 2.2.1.1 引物设计 根据绿色荧光蛋白基因序列设计了以下引物： 绿色荧光蛋白基因上游引物： 5-GTGAATTCTATGGTGAGCAAGGGCG-3（划线部分为EcoR I酶切位点） 绿色荧光蛋白基因下游引物： 5-CGGCATATGTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3（划线部分为Nde I酶切位点） 2.2.1.2 GFP基因扩增 在PCR管中分别加入 试剂 体积/µL PET-28a 1 10× PCR buffer 5 dNTPmix 4 Taq酶 0.25 GFP上游引物 0.5 GFP下游引物 0.5 ddH2O 38.75 总体积 50 反应程序： 94℃条件下使模板DNA变性5min。 变性 94℃ 30s 退火 55℃ 30s 延伸 72℃ 1min 最后在72℃条件下延伸10分钟。 反应完毕后各取3-5 µL 1%琼脂糖凝胶电泳检测。 2.2.1.3 PCR产物的纯化 用TAKARA公司的DNA试剂盒来提取纯化GFP基因 (1)使用TAE缓冲液或TBE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。 (2)在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸净凝胶表面的液体。 (3)切碎胶块。 (4)称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1mg=1ul进行计算。 (5)向胶块中加入胶块融化液DR-ⅠBuffer，DR-ⅡBuffer的量如下表： 凝胶浓度 DR-ⅠBuffer体积 1.0% 3个凝胶体积量 1.0%~1.5% 4个凝胶体积量 1.5%~2.0% 5个凝胶体积量 (6)均匀混合后75℃加热融化胶块。 (7)向上述胶块融化液中加入DR-ⅠBuffer量的1/2体积量的DR-ⅡBuffe，均匀混合。 (8)将试剂盒中的Spin Column 安置于Collection Tube上。 (9)将上述操作7的溶液转移至Spin Column中，12000rmp离心1分钟，弃滤液。 (10)将500ul的Rinse A 加入Spin Column中，12000rmp离心半分钟，弃滤液。 (11)将700ul的Rinse B 加入Spin Column中，12000rmp离心半分钟，弃滤液。 (12)重复操作步骤11。 (13)将Spin Column安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入25ul的灭菌蒸馏水或Elution Buffer,室温静置1分钟。（60℃的灭菌蒸馏水或Elution Buffer有利于提高洗脱效率。） (14)12000rpm离心1分钟洗脱DNA。 2.2.2 构建融合GFP基因的重组质粒pGreenYU 2.2.2.1 GFP基因的双酶切 在无菌的微量离心管内加入以下反应成分： 试剂 体积/ ul GFP基因 30 EcoRⅠ 1 NdeⅠ 1 Buffer H 4 ddH2O 4 总体积 40 反应体系在恒温水浴锅里37℃酶切4小时。产物在-20℃保存。 2.2.2.2对GFP基因双酶切体系进行纯化 参照2.2.1.3 PCR产物的纯化 2.2.2.3对PUC19质粒进行双酶切 在无菌的微量离心管内加入以下反应成分： 试剂 体积/ ul PUC19质粒 30 EcoRⅠ 1 NdeⅠ 1 Buffer H 4 ddH2O 4 总体积 40 2.2.2.4对PUC19质粒双酶切体系进行纯化 参照2.2.1.3 PCR产物的纯化 2.2.2.5将GFP基因双酶切产物连接到PUC19质粒双酶切产物中 在无菌的微量离心管内加入以下反应成分 试剂 体积/ ul GFP基因双酶切产物 6 PUC19质粒双酶切产物 2 T4 DNA连接酶 1 10×Buffer 1 总体积 10 先将GFP基因片段和PUC19质粒载体片段在45℃中温浴5分钟，再在冰浴中冰浴10分钟，然后先把Buffer加入体系中，再加T4 DNA连接酶，最后放到16℃的恒温水浴锅中连接24小时。 2.2.2.6感受态细胞的制备 （1）将DH5a活化24小时。 （2）取三角瓶中的菌液40ul,接种到含有4ml LB培养基的试管中摇6小时。 （3）将试管放置在冰浴中30min。取1.5ml菌液装到1.5ml离心管中，3000rmp离心5min,弃上清,用1000μL预冷的0.1mol/L CaCl2溶液悬浮沉淀。冰浴30min （4）4000rmp离心5min,弃上清,用200μL预冷的0.1mol/L CaCl2溶液悬浮沉淀。冰浴10min。 2.2.2.7将连接产物导入到感受态细胞 （1）感受态细胞200ul +8ul连接产物 （2）冰浴30min （3）42℃温浴90S。 （4）立刻冰浴5min。 （5）加800ul新鲜LB培养基。 （6）放置到摇床摇1小时 （7）3000rmp离心5min,吸取700ul上清培养基。 （8）打匀菌体，吸取菌体涂在含有氨苄青霉素的平板上。 （9）温箱培养 2.2.2.8提取质粒 碱裂解法小量制备重组质粒pGreenYU （1）取1.5 mL过夜培养的菌液，室温，6000rpm离心5min，弃去上清，倒置于吸水纸上，使培养液流尽； （2）加入100μL冰预冷的溶液Ⅰ（50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-Cl，10mmol/L EDTA，调pH至8.0），振荡混匀，冰浴5min； （3）加入200μL溶液Ⅱ（0.2mol/L NaOH，1%SDS），温和颠倒数次，混匀，冰浴5min； （4）加150μL溶液Ⅲ（5mol/L 醋酸钾60mL，冰醋酸11.5mL，ddH2O 28.5mL），上下颠倒混匀，冰浴5 min； （5）12000rpm，4℃离心10 min，将水相转至干净的1.5mL eppendorf管； （6）加入等体积酚/氯仿，上下颠倒混匀，12000rpm，离心5 min； （7）将上清移至另一1.5mL eppendorf管中，加入2倍体积乙醇（-20℃预冷），混匀，室温放置5min后，12000rpm，4℃离心10 min； （8）弃上清，沉淀加1mL 70%乙醇漂洗，12000rpm，4℃，离心5 min；弃上清，沉淀于室温或37℃干燥20-30min，加30μL左右的溶有RNA酶（20µg/mL）的ddH2O，溶解DNA，短暂振荡或用加样器上下吹打混匀，37℃作用30min； 取3-5μL进行1%琼脂糖电泳。 2.2.3对融合有GFP基因的重组质粒pGreenYU进行鉴定 2.2.3.1对重组质粒pGreenYU进行双酶切鉴定 在无菌的微量离心管内加入以下反应成分 试剂 体积/ ul 重组质粒pGreenYU 30 EcoRⅠ 1 NdeⅠ 1 Buffer H 4 ddH2O 4 总体积 40 2.2.3.2对重组质粒pGreenYU进行PCR鉴定 在无菌的微量离心管内加入以下反应成分 试剂 体积/µL 重组质粒pGreenYU 1 10× PCR buffer 5 dNTPmix 4 Taq酶 0.25 GFP上游引物 0.5 GFP下游引物 0.5 ddH2O 38.75 总体积 50 反应程序： 94℃条件下使模板DNA变性5min。 变性 94℃ 30s 退火 55℃ 30s 延伸 72℃ 1min 最后在72℃条件下延伸10分钟。 反应完毕后各取3-5 µL 1%琼脂糖凝胶电泳检测。 2.2.3.3对含有重组质粒pGreenYU的E.coli DH5α进行菌种保藏 （1）用火焰灭菌的接种环取斜面菌种在平皿上划线分离单菌落。 （2）平皿倒置于30℃或37℃恒温培养箱，培养24-48小时，至单菌落的大小为3mm左右。 （3）挑取一个单菌落，接种于一个装50mL的300mL三角瓶中30℃或37℃振荡培养10-15小时，至菌密度OD600为1.0-1.5。 （4）用火焰灭菌的接种环取少量种子液，涂片后，作革兰氏染色，在显微镜下观察菌体的形态，及是否有杂菌。 （5）按30%甘油：种子液为1：1（V/V）的量加入无菌甘油， 混合后分装至事先灭菌的菌种保存管（1-2mL/管），-70℃或液氮保存。 3 结果与分析 3.1 GFP基因的克隆 以pet-28a-GFP质粒为模板进行PCR扩增，产物经过琼脂糖凝胶电泳检测，发现在Marker 750bp附近有一条特异性条带，大小与GFP基因大小的理论值714相符。（如图1） 图1 绿色荧光蛋白基因的PCR扩增结果 M：DNA Marker 1：绿色荧光蛋白基因的PCR扩增结果 3.2 PUC19质粒酶切 用EcoR I酶和Nde I酶将puc19质粒进行双酶切，将puc19质粒多克隆位点下游EcoR I酶切位点和Nde I酶切位点的LacZ基因片段切下，从图2中我们可以发现成功切下了大约250bp左右的基因片段，这与EcoR I酶切位点和Nde I酶切位点之间的核苷酸片段的大小212bp相符。 图2 PUC19质粒的双酶切（EcoR I酶和Nde I酶） M：DNA Marker 1：puc19质粒双酶切产物 3.3重组质粒pGreenYU转化后平板培养和菌液离心后的结果 图3 左：转入重组质粒pGreenYU的大肠杆菌平板；右：菌液离心后的菌体沉淀 图3中左图为转入重组质粒pGreenYU大肠杆菌涂平板培养24小时后，在紫外光下可见菌落激发出较强荧光。图3中右图为收集转入重组质粒大肠杆菌菌液至离心管中，3500rpm离心5分钟后，在紫外灯下可见沉淀菌体激发出的较强绿色荧光。图3说明GFP基因片段已经在细菌内进行表达, 重组质粒pGreenYU的构建初步成功。 3.4重组质粒pGreenYU的双酶切和PCR扩增鉴定 图4重组质粒的EcoR I和Nde I双酶切电泳图 1：报告基因的重组质粒pGreenYU的双酶切条带； M：Marker 图5重组质粒为模板的PCR扩增GFP基因电泳图 1：扩增出来的GFP基因条带； M：Marker 图4中重组质粒在EcoR I和Nde I双酶切后，电泳跑出一条750bp左右的条带，长度与GFP基因理论值相符，表明从重组质粒pGreenYU中切出GFP基因片段。 图5中以重组质粒为模板的PCR扩增GFP基因，也扩增出跑长度750bp左右的条带，表明重组质粒pGreenYU中含有GFP基因。 这两张电泳图可以充份证明重组质粒pGreenYU中连入了GFP基因，重组质粒构建成功！ 4 讨论 4.1 重组质粒pGreenYU的优点 本实验通过对PUC19质粒进行双酶切，将PUC19质粒上的LacZ基因片段用GFP基因片段替代，连接到该质粒上，从而在PUC19质粒的多克隆位点上形成以绿色荧光蛋白序列为报告基因的新型质粒。他的表达产物无需任何底物和辅助因子，节省了传统方法所需的X-gal和IPTG,并且这一GFP突变体的激发波长移至可见光区，在日光下也可以用肉眼观察到绿色荧光。在紫外光下荧光更加强烈，不失为一种灵敏经济的质粒载体。其优点主要包括以下几点 （1）操作简单，结果一目了然。识鉴于绿色荧光蛋白的自发荧光特性，发光不需要其他的协助因子，因而可以把转化后的平板直接通过紫外照射，发出绿色荧光的菌体为空质粒菌体，而无绿色荧光的菌体为含有重组质粒的菌体。 （2）GFP的荧光反应不需要底物和辅助因子。只需要一定波长的紫外光照射就能发出明亮的荧光，肉眼也可以清晰地看到。 （3）GFP的荧光性质稳定。它的荧光衰减现象弱，抗酸碱能力强，适用温度范围大【10】。 （4）生理影响小。它与目的基因融合以后，不会对目的基因产生影响，转化后细胞仍然可以连续传代。 （5）构建载体比较方便。由于编码GFP的基因序列比较短，很适合构建质粒载体而且对质粒的转化效果影响很小【11】。 此克隆载体与近期发表的绿色荧光蛋白载体相比有一定的差异性和优越性。比如利用GFPS65T构建的克隆载体的多克隆位点比较少，只有6个，并且在日光下重组菌斑和空载菌斑的区分度不大【12-14】。而克隆载体pGreenLD也有不同程度的减少了几个酶切位点Not I、Sac I等【15】。相比之下本实验的新型荧光克隆载体pGreenYU在不减少多克隆位点的情况下保持了前几种荧光载体的优点。因此我们相信，新型绿色荧光载体的前景比较广阔，实用价值相对比较高。 4.2 重组质粒pGreenYU的缺点 本研究可以应用于重组质粒筛选，但是GFP表达后要调节荧光强度比较困难，不能像荧光素那样通过增加底物来扩大荧光效果，这一点需要进一步改进。 对于重组载体pGreenYU对目的基因的使用范围有一定的局限性。对于需要通过重组puc19来克隆的目的基因序列中必须要有终止密码子。 4.3 荧光法和蓝白斑法的筛选效率 PUC19载体携带lacZ’基因，它编码β-半乳糖苷酶的N-末端（α-肽），并且处于可被安慰诱导物IPTG（异丙基硫代半乳糖苷，与乳糖结构类似但不能被β-半乳糖苷酶降解）诱导的启动子调控之下。质粒转化的宿主菌为LacZ△M15 基因型（含有编码N-末端缺陷型的β-半乳糖苷酶多肽的基因）。未重组的质粒转化宿主菌后，在IPTG 的诱导下，质粒与基因组分别表达缺陷但可以相互补偿的两个肽（即α-互补），形成了有功能的β-半乳糖苷酶，该酶能把培养基中无色的X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）底物分解成半乳糖和深蓝色的5-溴-4-氯-靛蓝。然而当外源DNA 插入质粒位于α-肽编码序列中的多克隆位点时，由于破坏了α-肽的阅读框架，因而不能表达出与宿主菌基因组表达的缺陷型β-半乳糖苷酶多肽发生α-互补。当用绿色荧光蛋白基因替代lacZ’基因后，没有在多克隆位点插入外源基因的PUC19载体可以表达有功能的绿色荧光蛋白，从而显示出绿色荧光，当多克隆位点插入外源基因时，破坏了绿色荧光蛋白基因的阅读框，从而不表现出绿色荧光，达到通过荧光筛选重组质粒的目的。此种方法不需要加额外的底物，只需紫外灯即可达到目的。 4.4 研究展望 本研究对PUC19质粒进行的改造，获得了以绿色荧光蛋白GFP基因为报告基因的新型质粒载体，可作为今后重组质粒筛选的新工具，有望简化重组质粒筛选过程、节约试剂成本、提升筛选效果。并且扩大了PUC19质粒和绿色荧光蛋白GFP的应用范围，同时为重组质粒筛选提供了一种有效的技术方案，为生命科学的研究起到一定的促进作用。但其筛选效果与传统蓝白斑相比孰优孰劣，有待将测试基因导入后检验其效果。 目前为止．大约有几十种不同特性的荧光蛋白可供选择使用，这些蛋白质的荧光光谱几乎覆盖了整个可见区。一个好的荧光蛋向需具备以下几个特点：抗酸、抗漂白、亮度高、成熟快及单体结构。随着对GFP的基础理论研究的深入。新一代GFP衍生物荧光信号和蛋白的可溶性等的明显提高，成像技术和显微镜的改进，新型计算机及应用程序的出现．相信这些问题终将得到解决。与此同时，随着基因工程技术和细胞工程技术的日益成熟，GFP一定会带来更多的应用价值．并进一步揭开生命的未解之谜【16】。 本研究还可以通过不同种类的荧光蛋白构建新的载体，从而来满足生命科学的研究需要，比如可以通过构建含有不同颜色的荧光蛋白载体来更好的区分我们所要的重组体菌斑。把多彩的颜色带到生物的研究当中。 参考文献 【1】Shimomura O.Structure of the chromophore of Aequorea green fluorescent protrin[J].FEBS Letters,1979,104:220-222. 【2】 Grebenok R J, Pierson E, Lambert G M, Gong F_C, Claudio L A, Ruth H C, Janes C C, David W G. 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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 目的：利用GFP作为报告基因，构建一种新型的质粒载体，可以通过激发光照射后有无荧光产生进行高效的重组质粒筛选，建立了一种快捷可靠、低假阳假阴性、高通量的细菌重组质粒筛选方法。这种融合GFP基因的新型质粒载体构建为筛选细菌重组质粒克隆提供新的技术方案。基本思路：通过引物设计对GFP基因进行扩增，然后构建含有GFP基因的PUC19质粒，再通过测试基因插入到重组质粒中进行检测效果。
科学性、先进性及独特之处
- 在近几年的基因工程技术研究过程中，常用的重组质粒克隆和空质粒细菌的筛选方法有最经典的利用a互补原理的蓝白斑筛选，还有质粒快检法、菌落PCR、菌落原位杂交、插入失活、限制性内切酶酶切反应等等。这些方法或多或少都存在操作繁琐、耗费资金、使用范围很窄、假阳性率高等缺点。因此我们需要研究一种新型的质粒载体 ，可以更简单高效、快捷可靠的筛选细菌重组质粒克隆。
应用价值和现实意义
- 本研究目的在于利用绿色荧光蛋白作为报告基因，构建一种新型的质粒载体，可以通过激发光照射有无荧光产生进行高效的重组质粒筛选，建立了一种快捷可靠、低假阳假阴性、高通量的细菌重组质粒筛选方法。这种融合荧光蛋白基因的新型质粒载体构建，不仅可以拓展绿色荧光蛋白的应用范围，而且为筛选细菌重组质粒克隆提供新的技术方案。
学术论文摘要
- 本研究主要内容是构建一种以绿色荧光蛋白（GFP）为报告基因的新型载体。实验用EcoRⅠ、NdeⅠ两种酶对PUC19质粒和GFP基因进行双酶切，将PUC19质粒上的原报告基因LacZ片段切下后连入GFP基因，形成以绿色荧光蛋白为报告基因的新型质粒载体pGreenYU。新载体转入到大肠杆菌DH5α，摇菌后发现菌液呈现出明显的荧光。提取菌液中的质粒载体进行酶切及PCR鉴定，结果证明，新型荧光载体pGreenYU构建成功。
获奖情况
- 在浙江省生命科学学科竞赛中获得优胜奖
鉴定结果
- 新型荧光载体pGreenYU构建成功
参考文献
- 蓝白斑筛选 质粒快检法 菌落PCR 菌落原位杂交 插入失活 限制性内切酶酶切反应
同类课题研究水平概述
- 绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)GFP是能在活细胞中表达的发光蛋白；作为荧光标记分子，GFP既具有敏感的标记检测率，又没有放射性的危害一个良好的细胞间信跟踪观测第二信使。 李寿东等构建了以gfpS65T基因作为筛选标记的新型克隆载体,建立了以绿/白斑筛选法筛选阳性重组子的新方法,替代LacZ蓝/白斑筛选,不需X-gal,经济,简单可行. Leff等用GFP标记遗传工程微生物以监测其在水环境中的存活和去向. 朱应等构建了带gfp基因的重组棉铃虫病毒.该病毒一次感染棉铃虫后不再重复感染,室内饲养3代，各代均可见典型的发绿色荧光的棉铃虫,表明病毒可以介导GFP标记其宿主,预计将为研究棉铃虫的迁飞和暴发规律提供强有力的手段. Sampali Banerjee Jitendra Kumar Anjali Apte-Deshpande Sriram Padmanabhan 五个人成功构建一种可以直接在大肠杆菌里研究直接表达的含有GFP的融合原核载体 Yuk等使用GFP作为标记能快速筛选出生长抑制环境下，仍能保持重组蛋白大量表达的CHO细胞。 目前，GFP已经被成功地用于靶向标记包括细胞核，线粒体，质体，内质网等在内的细胞器。用GFP进行亚细胞定位，避免了提纯蛋白，标记异硫氰酸荧光素等荧光染料，经显微注射或其他方式导入细胞的复杂方法，从而使研究蛋白在活细胞的准确定位变得简单易行。
