基本信息
- 项目名称：
- 板栗疫病菌Rab蛋白Ypt7的定位和功能研究
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 本研究构建pcpxHY2-ypt7-GFP载体，利用绿色荧光蛋白对板栗疫病菌Rab蛋白Ypt7进行定位，发现Ypt7定位于液泡内。利用高效基因打靶系统Δcpku80敲除板栗疫病菌ypt7基因，获得基因缺失突变体，通过观察基因缺失株与正常菌株之间的性状变化，明确该基因的功能，在板栗疫病菌的致病力上有新的突破。
- 详细介绍：
- Rab族蛋白是小G蛋白Ras家族最大的亚家族之一。研究表明它主要参与细胞内的囊泡运输，调节生物体内各种蛋白在细胞内外的正确运输和分配。我们在进行板栗疫病菌基因组序列分析时，发现一个与酵母菌Rap基因ypt7有高度同源性的基因, 并将其命名为cpypt7。研究发现ypt7基因与致病性和自噬相关。本研究克隆了cpypt7，利用绿色荧光蛋白对该基因编码的蛋白进行了准确定位，并采用基因敲除的方法对其功能进行了初步研究。构建pcpxHY2-ypt7-GFP载体，在荧光显微镜下观察到Ypt7蛋白定位于菌丝体的液泡。以△cpku80突变体作为出发菌株，通过同源双交换获得了3株cpypt7基因缺失突变体。观察基因缺失株与野生菌株之间的性状差异，发现缺失菌株菌落边缘呈锯齿状分化，菌落色素、致病力和分生孢子量都显著下降。该结果初步表明cpypt7基因的正常表达会影响到板栗疫病菌的菌落形态、产孢量、致病力。
作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 研究目的：对板栗疫病菌Rab蛋白Ypt7进行定位并对该蛋白进行功能研究，明确cpypt7基因与板栗疫病菌的致病力的关系。 基本思路：本实验采用绿色荧光蛋白基因作为标记基因对Ypt7的位置进行定位，并通过基因敲除的方法将cpypt7基因敲除，获得cpypt7基因的缺失菌株，对基因缺失株和野生株之间的菌落形态、产孢量及致病力的差异，明确基因的功能。
科学性、先进性及独特之处
- 科学性：本研究克隆了cpypt7，将其与GFP基因构成融合基因，转染细胞进行表达，可对Ypt7进行观察。并采用基因敲除对该基因的功能进行研究。先进性：本研究首次在板栗疫病菌中研究与Rab蛋白Ypt7的定位和功能。研究过程中应用的方法对其它病原真菌的研究起到借鉴作用。独特之处：本研究发现Rab蛋白Ypt7定位于在板栗疫病菌的液泡，cpypt7的表达会影响到板栗疫病菌的菌落形态、产孢量、致病力。
应用价值和现实意义
- 本作品加深了对板栗疫病菌Rab的认蛋白的认识，研究过程中应用的方法对其它病原真菌的研究起到借鉴作用，为将来改进真菌病害防治方法提供了新知识。
学术论文摘要
- Rab族蛋白是小G蛋白Ras家族最大的亚家族之一。研究表明它主要参与细胞内的囊泡运输，调节生物体内各种蛋白在细胞内外的正确运输和分配。我们在进行板栗疫病菌基因组序列分析时，发现一个与酵母菌Rap基因ypt7有高度同源性的基因, 并将其命名为cpypt7。研究发现ypt7基因与致病性相关。本研究克隆了cpypt7，利用绿色荧光蛋白对该基因编码的蛋白进行了准确定位，并采用基因敲除的方法对其功能进行了初步研究。构建pcpxHY2-ypt7-GFP载体，在荧光显微镜下观察到Ypt7蛋白定位于菌丝体的液泡。以△cpku80突变体作为出发菌株，通过同源双交换获得了3株cpypt7基因缺失突变体。观察基因缺失株与野生菌株之间的性状差异，发现缺失菌株菌落边缘呈锯齿状分化，菌落色素、致病力和分生孢子量都显著下降。该结果初步表明cpypt7基因的正常表达会影响到板栗疫病菌的菌落形态、产孢量、致病力。
获奖情况
- 无。
鉴定结果
- 无。
参考文献
- [1] Hebard F V, Griffin G J, Elkins J R. Developmental Histopathology of Cankers Incited by Hypovirulent and Virulent Isolates of Endothia-Parasitica on Susceptible and Resistant Chestnut Trees. Phytopathology, 1984, 74(2): p.140-149. [2] Merkel HW. A deadly fungus on the American chestnut, New York Zoological Society. 10th Annual Report ,1905, 5:97-103. [3] Hill man BI, Elkins R. Developmental histopathology of cankers incited by hypovirulent and virulent isolates of Endothia parasitica on susceptible and resistant chestnut tress. Phytopathology ,1984, 74:140-149 [4]Griffin GJ. Chestnut blight and its control. Hort Rev, 1986, 8:293-335 [5]Nuss D.L. 1992. Biological od chestnut blight: an example of virusmediated attenuation of fungal pathogenesis. 56:561-576. [6]Guledner U, Heck S, Pleder T, et al. A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast. Nucleic Acids Ren, 1996, 24(13): p. 2519-2524.
同类课题研究水平概述
- 真核生物内膜系统各细胞器之间存在着脂类和蛋白之间的运输，这是通过复杂的囊泡运输和微管系统来完成的。Rab小G蛋白作为膜相关的分子开关，是囊泡形成、转移和融合过程中的核心调节因子，在囊泡的形成、转运、粘附、锚定、融合等过程中起作用。最新的人类基因组测序结果表明，人类至少有70个Rab蛋白[7]广泛存在于各染色体。就某个Rab而言，在哺乳动物和酵母中功能是保守的。板栗疫病是一种世界范围内的重要林木病害，引起板栗疫病的病原菌是板栗疫病菌，具备高度的遗传稳定性、有优良的遗传操作系统和全面的分子遗传学信息，广泛应用于植物以及病害的生物防治。绿色荧光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，这种蛋白质最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。利用绿色荧光蛋白独特的发光机制，可将GFP作为蛋白质标签，即利用DNA重组技术，将目的基因与GFP基因融合表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察。目前对板栗疫病菌基因功能的研究方法有RNA干扰和基于同源重组的基因敲除方法。研究中发现Δcpku80缺失菌株菌株中基因打靶效率均达到80%左右，但在野生型菌株EP155中仅为2-5%。板栗疫病菌高效基因打靶系统cpku80基因缺失突变体Δcpku80的成功构建，为在板栗疫病菌中进行大规模基因功能研究提供了强有力的工具。板栗疫病菌作为植物病原菌的研究模式，研究过程中应用的方法对其它病原真菌的研究起到借鉴作用。
