基本信息
- 项目名称：
- 构建以多重抗药性蛋白为载体的铜(II)生物荧光传感器
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 本课题选取了一种在大肠杆菌中十分重要的多重抗药性蛋白作为目标传感器的载体，结合一种高效的非天然氨基酸技术，在蛋白质的特定位点引入一活性基团与荧光探针相连，使得铜的浓度信号转化为光学信号。 作为一个能够响应铜(II)的生物大分子器件，除了在理论上能给蛋白质-金属相互作用带来更为深入的了解之外，实践应用前景也较为广阔，对于铜的细胞毒性、铜诱发的人类疾病等方面的研究有重大意义。
- 详细介绍：
- 为了解决现有活体铜(II)成像工具缺失的状况，使一些铜相关的疾病的研究能够深入展开，本课题设计构建了一种铜(II)荧光生物传感器。主要的设计结合了非天然氨基酸、溶剂化显色荧光染料和点击化学反应三种前沿技术。 传感器利用MarR在铜(II)的诱导下会产生巨大的结构变化，从而使一些位点的氨基酸残基周围环境发生由富水到疏水，最终导致这些残基上的荧光小分子开启，产生荧光变化。 此传感器具有良好的检测下限，荧光变化达到一般荧光探针的要求。相信在完成后续体内实验后，我们能够将这项技术真正地推广到分子医学工程领域，为人类疾病的深入研究作出贡献。
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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 为了解决现有活体铜(II)成像工具缺失的状况，并且使一些铜相关的疾病的研究能够深入展开，我们设计了一种基于大肠杆菌多重抗药性蛋白(MarR)的铜(II)生物荧光传感器。 传感器的基本设计思路是利用MarR在铜(II)存在情况下产生的巨大构象变化，让一种固定在MarR特定部位的荧光小分子来响应这个构象变化，从而给出荧光信号。
科学性、先进性及独特之处
- 传感器的设计是建立在经典的蛋白质工程上，利用MarR两种状态下不同的构象进行设计。这些设计有许多文献和已解出的MarR晶体结构为依据，是一种理性化设计而不是简单的尝试-错误(Try-Error)设计体系。其先进性和独特之处在于此传感器是第一个可用于细胞内成像的铜(II)传感器。
应用价值和现实意义
- 作品可广泛应用于细胞成像，特别是神经生物学的研究。比如研究在不同的神经刺激下铜(II)分布情况的改变，来推导出铜(II)参与何种神经调节过程。其也可应用于分子医学中，对于一些铜相关的疾病研究有着重要意义。
学术论文摘要
- 在这项课题中，大肠杆菌中普遍存在的一种多重抗药性蛋白(MarR)的特殊性质被详细研究，使用了聚丙烯酰胺凝胶电泳、快速蛋白质液相层析系统和ANS荧光滴定等实验技术手段，发现其能对铜(II)信号产生特异性的响应。 在此事实基础之上，结合非天然氨基酸(Unnatural Amino Acid)、溶剂化显色荧光染料和点击化学反应(Click Reaction)三种前沿技术，我们设计并且成功地开发了一种新型活体铜(II)生物传感器。其利用MarR在铜(II)的诱导下会产生巨大的结构变化，从而使一些位点的氨基酸残基周围环境发生由富水到疏水，最终导致这些残基上的荧光小分子开启，产生荧光变化。 我们对所构建的传感器进行了初步的体外(in vitro)荧光性质实验的测试。从实验结果来看，传感器具有良好的检测下限（灵敏度），同时其荧光变化达到一般荧光探针所要求的变化量。相信在完成后续体内(in vivo)实验后，我们能够将这项技术真正地推广到分子医学工程领域，为人类疾病的深入研究作出贡献。
获奖情况
- 1.在研项目，尚未公开发表，论文已递交美国化学会审阅，将发表于美国化学会期刊(Journal of American Chemistry Society, JACS,影响因子8.2)。 2.xx大学第十九届挑战杯--特等奖 3.第六届首都挑战杯--一等奖
鉴定结果
- 无
参考文献
- 铜生物传感器相关 1.SC Dodani et. al, Calcium-dependent copper redistributions in neuronal cells revealed by a fluorescent copper sensor and X-ray fluorescence microscopy, PNAS, 2011 2.SV Wegner et. al, Dynamic Copper (I) Imaging in Mammalian Cells with a Genetically Encoded Fluorescent Copper (I) Sensor, JACS, 2010 MarR(多重抗药性蛋白)相关 3.MN Alekshun et. al,The crystal structure of MarR, a regulator of multiple antibiotic resistance, at 2.3 Å resolution, Nat Struc, 2001 非天然氨基酸技术相关 4.L Wang et. al, Expanding the genetic code of Escherichia coli, Science, 2001 点击化学反应相关 5.HC Kolb et. al, Click chemistry: diverse chemical function from a few good reactions, Angew Chemie, 2001 溶剂化显色荧光染料相关 6. GS Loving et. al, Monitoring protein interactions and dynamics with solvatochromic fluorophores, Trends in biotech, 2010
同类课题研究水平概述
- 目前，国际上对于活体铜(II)生物传感器（特别是荧光传感器）的竞争十分激烈，有许多实验室都在各自开展对其开发的研究，其原因主要有以下几点。 1.铜的生物学研究还十分缺乏，并没有太多工具可以供人们使用去直接观察铜在细胞或者组织各个部位的含量与分布，以及铜在外界刺激下的富集与释放。 2.所有的铜传感器中，能直接用于细胞内成像的只有五个，最新的一个发表于2011年3月的美国科学院院刊。而其他所有传感器由于需要工作在有机溶液的环境下，使其毫无生物相容性可言。 3.上述的几个铜传感器都是对于铜(I)的检测，这是由于铜(II)在细胞中含量相对较低，并且其与镍(II)等离子的化学性质非常相似，难以开发出特异性高的传感器。而能够检测铜(II)的生物传感器又无法进行细胞成像。 综上，当前并没有关于铜(II)生物传感器的同类课题研究可供参考，因此本课题具有较好的创新性。完成后续部分工作，成功开发完成铜(II)传感器之后，对于相关的铜生物学研究有着非常重要的意义，例如 Alzheimer症和阮病毒症等一些尚未完全研究清楚，且病因十分复杂的神经疾病。 然而从生物荧光传感器的角度来看，这已经是一块研究进展十分迅速，并且竞争逐渐激烈的热门领域。自从Roger Tsein(钱永健)发现了GFP（绿色荧光蛋白）之后，人们开始利用这些荧光蛋白的基因编码特性，构建出了一系列的活体钙(II)生物传感器，开启了一个钙神经科学的时代，对于神经科学的研究带来了突破性的飞跃。 本课题所使用都是一些较为成熟，前人已经进行大量研究并且验证其有效性的技术，以这些技术为基础，独创性地将其有效地组合，从而完成我们所设计的铜(II)传感功能。就荧光染料这一技术而言，人们已经将其应用于体内pH、生命代谢产物和各种金属离子的检测等等，其检测效果都十分突出，说明这项技术确实有着巨大的优势。 以上所提及的工作和研究都已一并附于附加材料的部分。
