基本信息
- 项目名称：
- 产绿原酸金银花内生菌的分离研究
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 金银花为河南重要的地道药材，本作品以金银花为实验材料，对其根、茎、叶、花不同组织器官的内生菌进行分离、纯化；通过TLC、HPLC等方法对筛选出的内生菌次生代谢产物进行分析，筛选出3株产绿原酸的菌株，对其进行形态学鉴定，对筛选的高产绿原酸菌株的发酵培养基和培养条件进行优化选择，并对菌株发酵液进行抑菌学实验。为金银花活性成分-绿原酸的工业化生产提供理论依据。
- 详细介绍：
- 选取健康金银花植株的不同组织部位(新鲜根、茎、叶、花)作为内生菌分离实验材料，用平板划线法，点植法进行分离。实验过程中设有对照：吸取少量表面消毒中最后一次冲洗材料的无菌水，涂布于培养基上，经培养如无微生物长出，表明表面消毒彻底，分离到的是内生菌。经过反复分离、筛选、纯化出了107株内生菌，其后用菌落观察和镜检的方法去除重复，最终得到86株内生菌。对86株内生菌进行发酵后，用TLC法进行检测，结果显示次生代谢产物与绿原酸比移值相同的菌株有三株。为了确定这些次生代谢产物是否是含绿原酸，本次实验研究进一步用HPLC法对其进行检查，检测结果与TLC法结果一致。其后以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌为指示菌，通过琼脂扩散法对菌株抑菌活性进行研究，实验结果得出，菌株对金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌具有较强的抑菌活性，抑菌效果与金银花药材基本相同，而对大肠杆菌则表现出较弱的抑菌活性。利用形态比较法对菌落、菌丝体、孢子形态特征的认真观察分析，鉴定3株产绿原酸菌株，分别为毛霉属、曲霉属、青霉属。为了提高内生菌产生次生代谢产物的效率，对内生菌二次发酵的培养条件进行优化即：碳源、氮源以及培养温度进一步做了考察，最终确定最适培养条件为：发酵培养基为PDB培养基，培养条件为28℃，120r/min，震荡培养72小时。
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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 利用金银花内生菌的多样性，筛选出能产生金银花主要活性成分绿原酸的菌株，利用其进行微生物发酵来生产其主要活性成分，为人类突破植物资源周期长、产量低、不可再生等限制。本研究通过分离金银花到产绿原酸的菌株，并对培养条件进行优化，为今后利用金银花内生菌工业发酵生产绿原酸提供科学理论依据，具有很大的经济价值和研究意义。
科学性、先进性及独特之处
- 经文献检索，尚无发现有学者对金银花内生菌及次生代谢产物进行研究，首次从金银花中筛选出3株产金银花绿原酸的菌株，并对其发酵条件进行优化，筛选出最佳发酵条件。对3株筛选的菌种发酵液与金银花进行了抑菌对比试验，抑菌效果与药材效果基本相同。为金银花绿原酸发酵工业化生产提供依据。
应用价值和现实意义
- 基于目前金银花的生产和需求现状，利用其内生菌次生代谢产物来进行微生物发酵生产，生产其主要活性成分绿原酸，有助于人类突破植物资源周期长、产量低、不可再生等因素限制。利用内生菌进行发酵生产药物及生物防治能有效减缓当前药用植物资源逐渐短缺及环境污染日益严重的情况。
学术论文摘要
- 目的：通过对金银花不同组织器官内生真菌的分离，筛选能产生绿原酸的菌株，通过菌株的筛选及培养条件的优化，获得高产绿原酸的发酵菌株及培养基和培养条件。方法：从金银花不同组织器官中分离内生真菌，通过分离纯化，对其发酵产物进行TLC和HPLC分析，同时利用显微观察法对其进行形态学鉴定，对筛选的高产绿原酸菌株的发酵培养基和培养条件进行优化选择，并对菌株发酵液进行抑菌学实验。结果：从金银花中分离筛选到三株纯化的的内生真菌，其浓缩发酵液与对照品有相同的迁移率，保留时间与对照品保留时间一致，结果表明，三株纯化内生真菌能产生绿原酸，分别属于青霉属，毛霉属，丝胞纲曲霉属。经过发酵条件的优化，确定最佳发酵培养基为PDB培养基，培养条件为28℃,120r/min，震荡培养72小时。结论：金银花不同器官中具丰富的内生菌，并有可产生与宿主相同的活性成分绿原酸，纯化的产绿原酸菌株的发酵液具有明显的与金银花相同的抑菌效果。
获奖情况
- 2011年河南省第九届“挑战杯”大学生课外学术科技作品省级竞赛特等奖；2011年河南中医学院第四届“挑战杯”大学生课外学术科技作品校级竞赛二等奖
鉴定结果
- 无
参考文献
- [1]项勇，崔京霞，吕安国．东北红豆杉内生真菌的分离和筛选[J]．东北林业大学学报，2002，30(3)：30-34． [2]马天有，董兆麟．植物分离产紫杉醇的内生真菌的研究[J]．西北大学学报，1999．29(1)：47-49． [3] 项勇，崔京霞.东北红豆杉内生真菌的研究[J],东北林业大学学报 ，2002,30（2）：30-34 [4]李海燕．一种桃儿七内生真菌的分离初报．云南大学学报，1999，21(3):243 [5]一株产鬼臼毒素内生真菌发酵条件的研究[J].西北大学学报 [6]魏景超.真菌鉴定手册[M].上海:上海科学技术出版社,1979.
同类课题研究水平概述
- 研究发现某些内生菌可以产生与宿主植物相同或类似的产物，这一发现可能在一定程度上解决了某些药物来源短缺的问题。近年来先后从红豆杉（Taxus），长春花等药用植物中分离得到了内生真菌，并从这些药用植物内生真菌中分离得到了和宿主植物研究相同或相似的活性成分。内生菌作为许多重要药用成分的新来源，可工业化生产而不受土壤气候以及资源的限制，从而缓解了药源的短缺。目前已经从红豆杉、长春花、银杏等植物中分离出能产生活性成分的内生真菌[1,2,3]。 1993年Stiede首次从短叶红豆杉(Taxus breviflia)中分离得到一株能合成抗癌物质紫杉醇的内生真菌(Taxomyces andreanae)，此后对东北红豆杉也进行了研究[3]。云南大学张玲琪等从桃儿七（Sinopodophyllum hexandrum）的茎中分离到能够产生鬼臼毒素的内生真菌[4,5,6]。从长春花植株中分离出21株真菌，其中有4 株能够产生长春新碱类似物，它们分别属于镰刀菌属、交链孢属和无孢菌群等， 从桃儿七植株中共分离得到28株真菌，其中有两株能够产生鬼臼毒素类似物，它们分别属于青霉属和交链孢属。1999年，中山大学王伟等人从南方红豆杉(Tchinensis var．mairei)中分离得到87株内生真菌，其中有6个菌株能分泌紫杉烷类化合物，它们分别属于头孢霉属、轮柄梳霉属和无孢菌群等。通过比较发现， 以上产生与宿主相同或相似生理活性成分的内生真菌菌株之间并不存在种属联系，表明内生菌具备这一能力并不是偶然现象。这些发现掀起了一场从药用植物中分离内生菌的热潮，为人类解决某些药用植物生长缓慢、资源短缺等问题提供了新思路。
