基本信息
- 项目名称：
- 银耳酸性多糖分离纯化及抗氧化机理研究
- 来源：
- 第十一届“挑战杯”国赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 目前关于多糖的制备、结构、药理学、临床学等方面已有大量研究，其多方面的生物活性已经得到开发和应用。但由于分离到的多糖，大多数都是一些未经优化的杂多糖。加之生长环境、提取分离技术的不同而造成多糖结构及活性的差异。不利于发挥多糖的最佳功效，给进一步研究带来了困难，使在分子水平上阐明其药理作用和作用机制受到很大限制。 本研究综合利用现代分析手段，解决多糖的纯化技术，形成工艺化方案或纯品标准，为多糖类生物活性物质的研究提供解决方案。本多糖的纯化技术已经应用于银耳、柴胡、川芎、枸杞、牛膝和多种食用菌多糖的研究。 本研究在体外化学模拟建立抗氧化模型对银耳纯一多糖进行筛选。从清除自由基方面的能力来评价多糖的生物活性。本研究对银耳多糖进行深入研究，并综合利用现代分析手段，解释银耳多糖抗氧化机制，为探索多糖生物学活性研究方案提供参考。
- 详细介绍：
- 一：首次获得了银耳酸性多糖组分TPP2。通过对四川省道地药材通江银耳进行提取、分离和主要成分筛选。采用水提醇析法提取多糖，银耳多糖经DEAE-Sepharose Fast Flow柱层析，获得了通江银耳活性多糖成分－TPP2。 二：首次对不同产地的银耳进行了比较研究。通江银耳TPP2含量高达95.54%，其它产地银耳TPP2含量在0.6％～79.25％之间。 三：建立了通江椴木银耳的简易鉴别方法。从银耳的形体和吸水率两个方面进行鉴别。在形体上，通江椴木银耳的子实体比其它银耳的要小且短而密，胶质体厚、质地较硬，而其它银耳的子实体较大、胶质体薄、质地较软。在吸水率上，椴木银耳的吸水一般在2~4倍之间，而其它银耳的吸水率在8倍以上。 四：多糖含量测定方法改进。改进后的方法与老方法相比最大的优点是提高了检测的重现性与准确性。并且简化了操作（老方法取样四次，新方法取样两次），这样减少了偶然误差和系统误差的产生，有利于用于实际工作中对糖的检测。 五：TPP2体外抗氧化试验。以清除羟基自由基、超氧阴离子自由基和对油脂的抗氧化能力试验，建立体外试验模型。体外实验表明，TPP2清除羟基自由基EC50为66.5g/mL；TPP2清除超氧阴离子自由基（O2-•）EC50为 0.264 mg/ml。TPP2抗氧化能力优于VE，接近VC。 六：TPP2清除自由基作用机制初探。TPP2可以通过捕捉脂质过氧化链式反应中产生的自由基，达到对自由基的直接清除作用；TPP2通过与产生自由基所必需的金属离子发生络合作用，对自由基起间接清除作用。TPP2可通过提高SOD、GSH - Px等抗氧化酶的活性，从而发挥抗氧化的作用。
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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 本研究综合利用现代分析手段，解决多糖的纯化技术，形成工艺化方案或纯品标准，为多糖生物活性物质的研究提供解决方案。 本研究在体外化学模拟建立抗氧化模型对银耳纯一多糖进行筛选,并综合利用现代分析手段，解释银耳多糖抗氧化机制，为探索多糖生物学活性研究方案提供参考。 银耳多糖的分离及含量测定→多糖的纯化→银耳多糖的单糖组成→多糖抗氧化体系建立→银耳多糖抗氧化能力评价→多糖抗氧化机理初探
科学性、先进性及独特之处
- 一：通过对银耳多糖进行分离纯化，首次获得了银耳酸性多糖组分TPP2。 二：首次对不同产地的银耳进行了比较研究。通江银耳TPP2含量最高。 三：从银耳的形体和吸水率两个方面，建立了通江椴木银耳的简易鉴别方法。 四：对多糖含量测定方法进行了改进。简化了操作、提高了检测的重现性与准确性。 五：以清除自由基和对油脂的抗氧化能力试验，建立体外试验模型。对TPP2清除自由基作用机制进行了初步探索。
应用价值和现实意义
- 建立了通江椴木银耳的简易鉴别方法，已经被巴中市通江县采用。该项工作填补了国内空白。 改进了多糖含量测定方法，检测的重现性与准确性高。目前，已经在我校重点实验室的多糖研究中成为标准方法。并被《生物化学实验》在教学中采用。 多糖纯化技术已经应用于柴胡、川芎、枸杞、牛膝和多种食用菌多糖的研究。 在体外化学模拟建立抗氧化模型，解释银耳多糖抗氧化机制，为探索多糖生物学活性研究方案提供参考。
学术论文摘要
- 目前关于多糖的制备、结构、药理学、临床学等方面已有大量研究，其多方面的生物活性已经得到开发和应用。但由于分离到的多糖，大多数都是一些未经优化的杂多糖。加之生长环境、提取分离技术的不同而造成多糖结构及活性的差异。不利于发挥多糖的最佳功效，给进一步研究带来了困难，使在分子水平上阐明其药理作用和作用机制受到很大限制。 本研究综合利用现代分析手段，解决多糖的纯化技术，形成工艺化方案或纯品标准，为多糖类生物活性物质的研究提供解决方案。本多糖的纯化技术已经应用于银耳、柴胡、川芎、枸杞、牛膝和多种食用菌多糖的研究。 本研究在体外化学模拟建立抗氧化模型对银耳纯一多糖进行筛选。从清除自由基方面的能力来评价多糖的生物活性。本研究对银耳多糖进行深入研究，并综合利用现代分析手段，解释银耳多糖抗氧化机制，为探索多糖生物学活性研究方案提供参考。
获奖情况
- [1]颜军,徐光域,郭晓强等.银耳粗多糖的纯化及抗氧化活性研究,食品科学，2005,26（9）:169-172； [2]颜军,郭晓强,徐光域等.银耳多糖的提取及其清除自由基作用,成都大学学报,2006,25(1):35-38； [3] 2007年，通江银耳质量标准研究及产品开发，获四川省科技进步三等奖； [4] 2007年，通江银耳质量标准研究及产品开发，获成都市科技进步三等奖； [5] 2008年，一种速溶银耳粉的制备方法和所制得的速溶银耳粉，获国家专利授权。
鉴定结果
- 该项目不仅建立了通江银耳的质量标准，而且研制成套实用技术三套，专利1项，论文9篇，是一项在中药药食同源领域研究难度大，技术含量高，应用效益好，推广前景广阔的成果，在国内同类研究中居领先水平。
参考文献
- [1]夏尔宁,陈琼华.银耳子实体多糖的分离、分析及生物活性[J].真菌学报,1988 ,7 (7) :166-174. [2]颜军,徐光域,郭晓强等.银耳粗多糖的纯化及抗氧化活性研究,食品科学，2005,26（9）:169-172. [3]颜军,郭晓强,徐光域等.银耳多糖的提取及其清除自由基作用,成都大学学报,2006,25(1):35-38. [4]颜军,郭晓强,邬晓勇等. 非衍生化HPLC法分析银耳多糖中单糖组成的初步研究,食品科学,2007,28（7）:446-449. [5]Masaki H, Kaluta M.Studies on interrelation of structureand antitumor effects of polysaccharide[J ]. Car Res , 1981 ,92 : 115-129. [6]Nanba H, Kuroda H.The chemical structure of an antitumorpolysaccharide in mycelia of Cochliobol us myabernus [ J ].Chem Pharm Bull , 1987 (3) : 1285-12881
同类课题研究水平概述
- 近年来，银耳的研究主要集中在免疫增强及其机制上，银耳的诸多生理活性(包括抗肿瘤在内)都是建立在多糖对免疫增强的基础上。癌症的发生和人体衰老是多因素引起的多阶段过程，自由基学说是主要学说之一。基于自由基学说，活性自由基在复杂的多阶段癌变中起重要作用。因此，人体补充适量的自由基清除剂是抗衰老的主要措施之一。清除自由基对人体健康具有重要意义。 目前，多糖研究的层次与水平，还远远落后于蛋白质和核酸，主要集中体现在多糖结构与功能的关系、体内代谢过程与作用机制尚未阐明。限制多糖研究的主要“瓶颈”问题是多糖的分析手段欠缺与构效关系不明确，从而导致难以在分子水平阐明药理作用和作用机制。 1.银耳多糖现有分离纯化方法和手段 近年来，文献资料关于多糖的分离纯化的报道很多，但方法大多雷同。课题组在这方面也做了大量的工作。由于银耳多糖的分子量巨大。目前的分离方法一般是采用柱分离的手段。 首先，采用DEAE-纤维素柱色谱法，不仅可以分离多糖，而且能达到脱色的目的。然后，采用凝胶柱色谱法，根据多糖分子大小和形状的不同实现分离，以不同浓度的盐溶液和缓冲溶液作为洗脱剂，使不同大小的多糖分子得到分离纯化。 测定多糖纯度的方法有很多，如电泳主要是采用醋酸纤维薄膜电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、玻璃纤维纸电泳等。另外，常采用的是色谱技术，以各种凝胶的柱色谱较好，必须得到单一对称狭窄的峰。但由于多糖结构的复杂性，给多糖的纯度鉴定带来了很多困难。多糖的电泳所检查的带一般都较宽。色谱法则应该用三种以上的色谱系统证明样品的纯度。 2.多糖的生物功能可以测定，但反应机制并不清楚，缺乏分析手段。 文献报道，多糖具有较多的生物功能且作用明显。要评价多糖的生物活性采用的方法主要是清除自由基的体外实验和动物实验。但无论是体外模型还是动物实验，其主要作用是对多糖的抗氧化能力进行评价。虽然报道了很多多糖都具有清除自由基的作用，但其作用机理不明。目前，还未见采用这些模型来进行银耳多糖抗氧化机理研究的报道。究其原因是对反应机理的研究手段的欠缺。 综上所述，长期研究发现，银耳多糖又具有较高的生物活性。因此，有必要对银耳多糖进行生物活性筛选，深入研究活性银耳多糖的序列结构，为银耳多糖生物活性的机理阐释、构效关系研究提供新方法和新手段。
