基本信息
- 项目名称：
- 中国林蛙核糖核酸酶基因表达及抑制细菌生长活性的研究
- 来源：
- 第十一届“挑战杯”国赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 本研究项目利用基因克隆和表达的方法，以我国特有生物林蛙的基因组为模版，成功地克隆了两个核糖核酸酶基因顺序，两者之间氨基酸顺序的差异大约50%。在国际基因库中发现他们分别与蛙类核糖核酸酶中：onconase和lectin样酶分别具有76%和84%的顺序的相似性。该顺序结果已经报国际GeneBank(EU384703和EU384704)。进一步我们通过诱导表达，得到了两个基因的重组蛋白，初步分离纯化后的抑菌试验显示，我们重组的lectin样的酶具抑菌作用。而onconase样的酶不具抑菌作用。
- 详细介绍：
- 研究背景： 糖核酸酶A家族是一个蛋白质家族，其成员在氨基酸一级结构以及空间结构上具有不同程度的相似性，因而具有不同程度的酶活性。 近年来，人们陆续从不同动物不同组织中发现许多种该酶家族的成员，它们除或多或少（或缺）地具有酶活性外，还具有其他的一些活性，如：抗病毒、抗肿瘤、免疫抑制、血管生成以及抑制细菌生长等方面的一些特殊的生物学活性。有关研究中最引人注目的是onconase，由于其来源的特殊性和抗人类肿瘤细胞生长的活性，它已成为抗肿瘤药物的研究重点，目前正在进行第Ⅲb期临床试验。 由于哺乳动物核糖核酸酶受到人体内抑制剂的作用，因而影响了酶的研究和进一步的应用。两栖动物来源的酶不受哺乳动物抑制剂的作用。因此，形成了一个热点研究领域。 蛙类酶的研究国外主要集中在美洲豹蛙、牛蛙和日本稻田蛙。已发现十几种核糖核酸酶，根据顺序的相似性分为三个组，即：Onconase、Lectin以及Amphinase组。 本研究项目，利用我国特有的两栖动物林蛙的基因，研究酶的特殊生物学活性，目前已经克隆和表达了林蛙的两个基因，并对其抑菌活性进行了初步的研究。 方法结果： 利用基因克隆和表达的方法，成功得到了两个核糖核酸酶基因顺序。这两个顺序均具有该酶家族的保守顺序，两者之间氨基酸顺序的差异大约50%。在国际基因库中发现他们与蛙类核糖核酸酶中：onconase和lectin样的最相似的酶分别具有76%和84%的顺序的相似性。该顺序结果已经报美国GeneBank（ EU384703和EU384704）。其次，我们得到了重组的酶蛋白，经初步分离纯化后的抑菌试验结果显示：我们重组的lectin样的酶具抑菌作用；而onconase样的酶不具抑菌作用。 项目特点： 本项目追踪了国际相关研究的热点问题，利用了我国特有的物种基因资源，表达了林蛙的两个核糖核酸酶基因，为进一步的应用打下了一个基础，也弥补了我国在该领域的空白。 不足及展望： 实验中，重组lectin样核糖核酸酶显示细胞毒性，给诱导表达带来困难。希望经进一步的研究，使其能够大量表达，进一步为生物抗菌药物的研发奠定基础；Onconase样的重组酶的抗肿瘤活性研究，也将使我国在该类抗肿瘤酶的应用方面赶超国际先进水平。
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撰写目的和基本思路
- 本研究旨在发现我国特有两栖动物林蛙的核糖核酸酶的基因及其功能，检验其抑菌作用，为进一步临床应用打下基础。 近年来，国外利用当地蛙类资源获得了多种核糖核酸酶的基因产物。这些酶除具有水解RNA的活性外，还具有一些特殊的生物学活性，如抗病毒以及抑菌等活性。 本研究以我国特有生物林蛙为对象，利用基因克隆和表达的手段获得重组蛋白，并对其抗菌活性进行初步测定，以期发现具有抗菌活性的林蛙核糖核酸酶。
科学性、先进性及独特之处
- 利用我国独特基因资源，研究中国林蛙核糖核酸酶基因结构、表达重组蛋白的抑菌作用。成果可望具有我国自主知识产权。 追踪国际相关领域的科学进展，其研究成果为本项目提供较好的实践和理论支撑。围绕生物制药和抑菌的大课题，符合经济发展的需要，具有广阔的应用前景。 国外对蛙类核糖核酸酶的研究局限在牛蛙，豹蛙和日本稻田蛙；国内林蛙的研究也限于细胞水平。本项目无疑将给该领域的研究带来新的内容。
应用价值和现实意义
- 具有抗菌活性的多肽和蛋白质生物制剂的出现，给抗菌治疗开辟了广阔的前景。 本实验通过克隆和基因表达，探讨我国两栖动物核糖核酸酶抑菌的活性，为进一步研究该酶的特殊生物学活性打下基础，填补我国林蛙核糖核酸酶研究的空白；同时也为林蛙核糖核酸酶应用于细菌性疾病的治疗打下基础。表达我国林蛙核糖核酸酶、发现其抗菌作用，无疑将对我国林蛙的基因利用和生物制剂的抗菌研究和应用产生一个新的影响。
学术论文摘要
- 现今抗生素是治疗感染性疾病的主要药物，随着抗菌药物过多和过滥的使用，致使细菌对抗生素的耐药性增加，疗效下降，使抗生素的作用不再像以前那样有效。具有抗菌活性的多肽和具有抗菌活性的蛋白质生物制剂的应用将会为抗菌治疗带来新的更加广阔的前景。 近年来，越来越多的研究表明，核糖核酸酶（Ribonuclease，RNase）不仅具有消化酶的功能，而且还可作为一种有选择性的细胞毒素，具有抗病毒和抑制细菌等特殊的生物学功能, 在疾病的诊断和治疗方面表现出重要的应用价值。 本课题旨在从林蛙中克隆和表达具有抑制细菌活性的核糖核酸酶，并进行抑制细菌生长的抑制作用的研究。本研究从林蛙基因组中，克隆和表达了2种核糖核酸酶，通过检索基因文库， 发现它们分别与onconase和lectin样的核糖核酸酶具有最大的相似性，分别为76%和84%。两个顺序均保留蛙类核糖核酸酶的保守区域，而两者之间氨基酸顺序具有大约50%的不同。初步的抑菌试验显示：其中lectin样的重组酶具有抑制细菌生长的活性，而onconase样的不具有抑菌活性。
获奖情况
- 尚无
鉴定结果
- 尚无
参考文献
- [1] W. Ardelt, S.M.Mikulski, K. Shogen. Amino acid sequence of anti-tumor protein from Rana pipiens oocytes and early embryos. J.Biol.Chem. 1991, 266:245-251. [2] YouDi Liao, HueyChung Huang, YinJen Leu, et al. Purification and cloning of cytotoxic ribonucleases from Rana catesbeiana. Nucleic Acids Research. 2000, 28(21): 4097-4104. [3] Torrent G, Rib M, Benito A, Vilanova M. Bactericidal activity engineered on human pancreatic ribonuclease and onconase. Mol. Pharm. 2009 Feb 4. [4] Yang D, Rosenberg HF, Chen Q, et al. Eosinophil-derived neurotoxin (EDN), an antimicrobial protein with chemotactic activities for dendritic cells. Blood. 2003, 102(9):3396-403. [5] Zhang J, Dyer KD, Rosenberg HF. Human RNase 7: a new cationic ribonuclease of the RNase A superfamily. Nucleic Acids Res. 2003, 31(2):602-7. [6] H.F. Rosenberg, Jianzhi Zhang, YouDi Liao, et al. Rapid diversification of RNase A super family ribonucleases from Bullfrog, Rana catesbeiana. J Mol.Evol .2001, 53:31-38.
同类课题研究水平概述
- 核糖核酸酶A超家族（Ribonuclease A superfamily; RNase A superfamily）是由一组结构相似的蛋白质构成的蛋白质家族，它们在氨基酸残基的组成和空间结构上的相似性决定了它们具有相似的酶活性。最早发现并深入研究过的牛胰核糖核酸酶就是这一大家族成员的原型。它们共同的酶活性表现为：在组成RNA的核苷酸残基的3’端水解RNA。这一点提供了我们检测RNase酶活性的基本方法。 目前，已经有许多核糖核酸酶家族的成员被分离和表达出来。它们来源于不同的物种，包括哺乳动物、啮齿动物、爬行动物、两栖动物等，以及同一物种的不同器官，具有不同程度的酶活性和广泛的生物学活性，如：抗病毒、抑制细菌生长、促进血管生成、免疫抑制以及抑制肿瘤细胞生长等活性，在治疗爱滋病、抑制细菌病毒感染和人类肿瘤治疗等临床医学应用领域具有广阔的远景，已成为当前一个活跃的研究领域。例如，人类基因组中存在有13种核糖核酸酶。其中，嗜酸性粒细胞来源的神经毒素（EDN，RNase2）和碱性蛋白（ECP，RNase3）分别显示出抑制细菌和病毒生长的活性；RNase5被认为是血管生成素（angiogenin）；RNase7 显示出抑制细菌生长的功能。 为了进一步证实某些酶的特殊生物活性，人们试图在哺乳动物和啮齿动物中寻找这些酶的对应物（conterparts），结果发现：小鼠核糖核酸酶也具有抑制病毒繁殖和抑制细菌生长的功能。 由于哺乳动物胎盘来源的核糖核酸酶抑制剂对哺乳动物核糖核酸酶存在普遍的抑制作用，阻碍了酶与其受体的结合，进而抑制了酶的应用。因此，两栖类动物来源的酶就成了人们寻找这种可为人类利用的具有细胞毒性的酶的热点研究领域。 目前，国内外同类课题的大量文献，有关核糖核酸酶的研究没有涉及中国林蛙，只是在豹蛙、稻田蛙、和牛蛙中做了相关的报道。而其他有关于林蛙的研究只是关于抗菌多肽的，没有在分子水平对林蛙的核糖核酸酶进行如此深入的研究。 现今，国外有关核糖核酸酶的抗肿瘤研究已经达到临床试验阶段，这也为核糖核酸酶在抑菌方面的应用奠定了坚实的基础。纵观其他人所做的研究发现：核糖核酸酶家族中的某些成员具有抑菌作用是较为肯定。所以，我们以林蛙核糖核酸酶的抑制细菌活性的研究，作为研究我国特有两栖动物特殊生物学活性的开始。
