基本信息
- 项目名称：
- 重组腺病毒感染血管组织的条件优化与表达效率比较
- 来源：
- 第十一届“挑战杯”国赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 以腺病毒为载体将外源基因导入动物体内的特定组织，是研究靶基因功能、探讨其对相关疾病发生发展影响的有效手段 ，而选择最佳条件向组织中导入重组病毒，对于获取真实的实验结果至关重要。本研究以大鼠颈总动脉为靶组织，采用不同条件向动脉壁导入重组腺病毒，观察病毒剂量和感染时间对感染效率和血管完整性的影响，并提供了一个优化的感染方案。利用这一优化方案，我们在构建了大鼠颈总动脉内皮球囊剥脱模型的基础上，将KLF4重组腺病毒导入损伤后的颈总动脉，观察外源性KLF4对血管内膜增生的防治效果。研究发现，外源性KLF4具有抑制损伤诱导的血管内膜增生的作用。这一结果为进一步研究KLF4在血管再狭窄中的作用提供了实验依据。本成果所建立的外源基因导入血管组织的方法具有简便、易行、感染率高、重复性好、效果显著等特点，已推广应用于其它相关课题的研究。
- 详细介绍：
- 以腺病毒为载体将外源基因导入动物体内的特定组织，是研究靶基因功能、探讨其对相关疾病发生发展影响的有效手段 ，而选择最佳条件向组织中导入重组病毒，对于获取真实的实验结果至关重要。本研究以大鼠颈总动脉为靶组织，采用不同条件向动脉壁导入重组腺病毒，观察病毒剂量和感染时间对感染效率和血管完整性的影响。将感染病毒分为10ul 、20ul 和40 μl组，每组分别选用10min，20min和30min的感染时间，然后观察感染效率。经免疫组化染色检测外源基因的表达产物(以此评价感染效率),发现重组腺病毒的感染效率具有剂量依赖性和时间依赖性，在不损伤血管壁结构完整性的条件下，以20 μl病毒量感染20 min时的感染效果最佳。本研究结果为以腺病毒为载体将外源基因导入血管组织，研究其在血管再狭窄中的功能提供了一个优化的感染方案。利用这一优化方案，我们在构建了大鼠颈总动脉内皮球囊剥脱模型的基础上，将KLF4重组腺病毒导入损伤后的颈总动脉，观察外源性KLF4对血管内膜增生的防治效果。研究发现，导入外源性KLF4组内膜增生程度较感染空病毒组明显减轻，表明外源性KLF4具有抑制损伤诱导的血管内膜增生的作用。这一结果为进一步研究KLF4在血管再狭窄中的作用提供了实验依据。本成果所建立的外源基因导入血管组织的方法具有简便、易行、感染率高、重复性好、效果显著等特点，已推广应用于其它相关课题的研究。
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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 以腺病毒为载体将外源基因导入动物体内的特定组织，是研究靶基因功能、探讨其对相关疾病发生发展影响的有效手段 ，而选择最佳条件向组织中导入重组病毒，对于获取真实的实验结果至关重要。本研究以大鼠颈总动脉为靶组织，观察病毒剂量和感染时间对感染效率和血管完整性的影响。证实重组腺病毒的感染效率具有剂量依赖性和时间依赖性，在不损伤血管壁结构完整性的条件下，以20μl病毒量感染20min时的感染效果最佳。
科学性、先进性及独特之处
- 1．本研究首次观察了病毒剂量、感染时间等因素对感染效率的影响，为制定科学、规范的外源基因导入方案提供了可靠的数据； 2．优化建立了重组腺病毒高效感染血管组织的方法，该方法具有简便易行、感染率高、重复性好、效果显著等特点，为研究目标基因在血管再狭窄中的作用及分子机制提供了可行的方法； 3．证明外源性KLF4可抑制损伤诱导的血管新生内膜的形成，为血管再狭窄的药物研发提供了分子靶标。
应用价值和现实意义
- 1.本研究所建立的方法已总结为研究论文，将在国内权威期刊《中国老年学杂志》上发表； 2.该方法被应用于其他相关课题的研究，取得了满意的结果； 3.该方法可用于研究目标基因在血管重塑性疾病的发生中所起到的作用及其分子机制，是解决相关理论问题所必需的关键技术，在心血管基础研究中具有应用价值。
学术论文摘要
- 以腺病毒为载体将外源基因导入动物体内的特定组织，是研究靶基因功能、探讨其对相关疾病发生发展影响的有效手段 ，而选择最佳条件向组织中导入重组病毒，对于获取真实的实验结果至关重要。本研究以大鼠颈总动脉为靶组织，采用不同条件向动脉壁导入重组腺病毒，观察病毒剂量和感染时间对感染效率和血管完整性的影响，并提供了一个优化的感染方案。利用这一优化方案，我们在构建了大鼠颈总动脉内皮球囊剥脱模型的基础上，将KLF4重组腺病毒导入损伤后的颈总动脉，观察外源性KLF4对血管内膜增生的防治效果。研究发现，外源性KLF4具有抑制损伤诱导的血管内膜增生的作用。这一结果为进一步研究KLF4在血管再狭窄中的作用提供了实验依据。本成果所建立的外源基因导入血管组织的方法具有简便、易行、感染率高、重复性好、效果显著等特点，已推广应用于其它相关课题的研究。
获奖情况
- 发表论文 1. 田文嘉，李晗，郑斌，等。重组腺病毒感染血管组织的条件优化与表达效率比较。中国老年学杂志，2009，(已录用，待发表)； 2．李晗，田文嘉，刘彬，韩梅。不同性别冠心病患者主要危险因素的比较。中国老年学杂志， 2009，29：189-190
鉴定结果
参考文献
- 1. Liu ZM, Zhang CX, Dronadula N, Li Q, and Rao GN. Blockade of Nuclear Factor of Activated T Cells Activation Signaling Suppresses Balloon Injury-induced Neointima Formation in a Rat Carotid Artery Model. J. Biol. Chem., 2005; 280: 14700 - 14708. 2. Shyu KG, Wang BW, Kuan P, and Chang H. RNA Interference for Discoidin Domain Receptor 2 Attenuates Neointimal Formation in Balloon Injured Rat Carotid Artery. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 2008; 28: 1447 – 1453 3. Schillinger M, Exner M, Minar E, Mlekusch W, Müllner M, Mannhalter C, Bach FH, and Wagner O. Heme oxygenase-1 genotype and restenosis after balloon angioplasty: a novel vascular protective factor.J. Am. Coll. Cardiol., 2004; 43: 950 – 957 4. Garl PJ., Wenzlau JM., Walker HA., Whitelock JM., Costell M, and Weiser-Evans MC. Perlecan-Induced Suppression of Smooth Muscle Cell Proliferation Is Mediated Through Increased Activity of the Tumor Suppressor PTEN Circ. Res., 2004; 94: 175 - 183.
同类课题研究水平概述
- 自上世纪80年代以来，基因治疗的概念由经典的基因治疗扩展到导入外源基因达到治疗目的的所有方法。为了将目的基因转入细胞中，选择适当的载体是非常关键的。常用的有非病毒的质粒、裸DNA、腺病毒(AV)、腺相关病毒和逆转录病毒等。 以腺病毒为载体将外源基因导入动物体内的特定组织，是研究靶基因功能、探讨其对相关疾病发生发展影响的有效手段 ，而选择最佳条件向组织中导入重组病毒，对于获取真实的实验结果至关重要。腺病毒载体的宿主范围大、转染效率高、滴度高、安全、较稳定、致癌的潜在危险性小,从而在体外基因的转移中具有很大的优势。本实验使用改造后的缺陷性AV-pAd/CMV/V5- DEST (删除了E1和E3基因)，含有巨细胞病毒启动子，可使目的基因快速、高水平表达，便于复制目的基因及筛选，但是需要在能表达E1基因的293A细胞中包装、产生、扩增，转染后在哺乳动物细胞内却不表达E1a、E1b蛋白且腺病毒基因不整合入宿主的基因组。因此，用pAd/CMV/V5-DEST作为目的基因载体比较安全。利用人腺病毒构建的载体可用于人类疾病的基因治疗，原因在于：①腺病毒的36kb双链DNA基因组易于以等级基因技术操作②感染宿主范围广③在许可细胞中病毒能有效复制⑤在非许可细胞中，病毒基因组以附加子形式存在，并持续表达一段时间。这些特点使得其成为应用于基因治疗有很大吸引力的候选载体。本研究以大鼠颈总动脉为靶组织，采用不同条件向动脉壁导入重组腺病毒，观察病毒剂量和感染时间对感染效率和血管完整性的影响并提供了一个优化的感染方案。 Krüppel样因子（Krüppel-like factors，KLFs）是一类含锌指结构的转录因子家族，主要参与调节细胞发育、分化、增殖和凋亡等过程。KLF家族中的KLF4高表达于上皮组织中，尤其是终末分化或有丝分裂后的肠上皮细胞，提示它与生长抑制相关。已有研究表明KLF4是一种生长抑制相关基因且它本身是一种细胞增殖抑制因子。为此利用上述优化方案，我们在构建了大鼠颈总动脉内皮球囊剥脱模型的基础上，将KLF4重组腺病毒导入损伤后的颈总动脉，观察外源性KLF4对血管内膜增生的防治效果。研究发现，导入外源性KLF4组内膜增生程度较感染空病毒组明显减轻，表明外源性KLF4具有抑制损伤诱导的血管内膜增生的作用。这一结果为进一步研究KLF4在血管再狭窄中的作用提供了实验依据
