基本信息
- 项目名称：
- 大鼠皮肤的冷冻干燥保存
- 来源：
- 第十一届“挑战杯”国赛作品
- 小类：
- 能源化工
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 在目前移植医学界，供体器官的保存和运输是亟待解决的问题之一，需要更有效、便捷的保存方法。 本论文通过自然界隐生生物在干燥状态下体内的变化得到用海藻糖进行干燥保护的设计。 论文进行了海藻糖载入条件的研究，进行了一系列的体外体内检测，做出了新的保存方法的探索。
- 详细介绍：
- 目前研究主要集中于研制保存效果好、保存时间长的器官灌注、保存液（4℃保存）方面，虽然取得了大量成果，但现有的方法对肝脏、胰腺保存不超过24 h，心脏保存不超过8 h，远远不能满足建立器官库的要求。 本实验提出的器官和组织的冷冻干燥保存是将负载保护剂的器官和组织在低温下冻结，然后在真空低温条件下使其中的水分直接升华而成为干燥状态的一种技术。干燥的器官和组织能够长时间稳定保存，并且在复水后恢复活性，大大减少储存和运输的不便，为器官和组织的保存提供了一种全新的方法，具有重大的科学价值和应用价值。应用干燥保存，即使出现HLA配型不符的情况，我们也可以将捐献器官和组织保存起来，当有配型相符的患者时再进行水化复苏、移植，从而有效利用器官和组织资源，对器官和组织的移植意义非常重大。
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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 目的：用海藻糖作为皮肤的干燥保护剂，优化其载入大鼠皮肤的条件，冷冻干燥负载后皮肤并进行体内、体外检测，探索皮肤的冷冻干燥保存的新方法。 基本思路：首先研究大鼠皮肤负载海藻糖的方法，即通过对培养液中海藻糖浓度、培养时间和温度的控制，优化出最佳条件；然后将负载海藻糖的皮肤冷冻干燥再保存；最后将干燥保存的皮肤水化，观察其组织形态，检测组织活性，并进行移植试验。
科学性、先进性及独特之处
- 海藻糖已被证明是生物体抵抗干燥损伤的关键因素，在Nature Biotechnology，Reproduction等杂志生已发表用海藻糖进行动物细胞干燥保存的相关文章。因此本论文的设计在理论上是可行的。 研究将冷冻干燥保存的概念引人器官和组织的保存中，未见有相关报道。 目前器官和组织的保存时间短，会产生冰晶损伤。本论文提出的冷冻干燥保存避免冰晶损伤，具新的思路。
应用价值和现实意义
- 目前器官和组织的保存是移植界的一大难题，其保存时间和保存效果都远不能满足移植的需求。 本文研究的冷冻干燥保存方法不但有利于节省资源，最大程度的发挥捐赠器官和组织的作用，对于组织工程产品的推广应用也将起到促进作用；而干燥状态下的器官和组织便于保存和运输，经过水化处理复苏后可以迅速恢复活力，方便用于移植。 因此，冷冻干燥保存方法的成功，对于器官和组织移植、组织修复和再生等领域，具有重要意义。
学术论文摘要
- 研究表明DMSO可作为细胞程序降温和冷冻过程的冷冻保护剂，同时海藻糖在生物有机体内积累可使其具备干燥耐受性。本项研究将海藻糖负载于皮肤组织中作为干燥保护剂，辅以DMSO，探索皮肤组织的冷冻干燥保存的新方法。首先研究大鼠皮肤负载海藻糖的方法，即通过对培养液中海藻糖浓度、培养时间和温度的控制，优化出负载的最佳条件；然后将负载海藻糖的皮肤冷冻干燥再保存；最后将皮肤水化，在显微镜下观察其组织形态，用MTT法检测组织活性，并进行移植试验。结果表明将大鼠皮肤在37℃，含800mM的海藻糖的培养液中孵育7h时皮肤获得最大海藻糖载入量。负载海藻糖的皮肤冷冻干燥组织经MTT活性检测仍保持30%的活性，其自体移植后有效保存时间可长达10天左右。因此负载海藻糖能在大鼠皮肤冷冻干燥保存中起到保护作用，也为研究器官和组织的冷冻干燥保存提供了一个新方法。
获奖情况
- 本论文于09年1月被《中国组织工程研究和临床康复》杂志接受
鉴定结果
参考文献
- 1．Bode AP, Fischer TH.Lyophilized platelets: fifty years in the making.Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol. 2007;35(1):125-33. 2．Wolkers W F, Tablin F,Crowe J H. From anhydrobiosis to freeze-drying of eukaryotic cells. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 2002;131: 535-543. 3．杨鹏飞，程启康，王欣等人体骨髓基质干细胞冷冻干燥的探索性实验。制冷学报。2005；26：19-23。 4．Gordon S L, Oppenheimer S R, Mackay A M, Brunnabend J, Puhlev I,Levine F. Recovery of human mesenchymal stem cells following dehydration and rehydration. Cryobiology. 2001;43: 182-87. 5． Castagnoli C， Alotto D， Cambieri I， Casimiri R， Aluffi M， Stella M， Alasia S.T， Magliacani G. Evaluation of donor skin viability: fresh and cryopreserved skin using tetrazolioum salt assay. Burns. 2003;29: 759.
同类课题研究水平概述
- 目前器官保存研究主要集中在研制保存效果好、保存时间长的器官灌注、保存液方面，现有的方法对大多数器官的保存都不超过24h。深低温冷冻保存的方法，已广泛用于细胞的保存。但对于大块器官和组织，复温过程中的重结晶对组织产生有害的冰晶损伤。 近年来，海藻糖（trehalose）成为研究的热点。越来越多的研究发现，海藻糖对干燥状态下的生物体具有保护作用。自然界中的酵母片和发面用酵母粉中的酵母均为活酵母，生活在苔藓表面的水熊，常常处于干枯状态，一旦得到水分，又重新复苏，甚至在干燥保存80年后，给一点水分仍能恢复生机，还有摇蚊等。而这些生物在干燥状态下的一个明显变化是体内海藻糖迅速增加，在生物干燥耐受性中其重要作用。 海藻糖（trehalose）是一种由两个葡萄糖分子以α,α,1,1-糖苷键构成的非还原性糖，性质非常稳定，并对多种生物活性物质具有保护作用。海藻糖可以增强细胞干燥耐受性的机理，目前主要有两种假说。一种称“水替代”学说，另一种称“玻璃态”学说。 哺乳动物细胞不含海藻糖，对于干燥的耐受性也要低得多。有研究将血小板于含有海藻糖的培养液在37℃孵育4h，冷冻干燥后在室温、真空条件下保存7个月，加入培养液复苏，复苏率达90%以上，而且保持其原有的形态与功能不变；对照组无海藻糖孵育，血小板复苏时溶解、聚集成团，失去应用价值。Bode等进一步研究发现冻干复水的人血小板的灌注1h后的止血时间与新鲜的人血小板1h的止血时间无统计学上的差别。说明海藻糖在具有简单结构的动物细胞血小板中起到了明显的保护作用。 Satpathy等将红细胞在800mM海藻糖培养液中37℃孵育7h，载入海藻糖，一定条件下回输未见临床不良反应。 Stephen L等将BMSC在50mM海藻糖和3%冷冻保护剂的DMEM中37℃下孵育24h后，将其干燥、真空保存并装船运输，耗时24h，环境温度变化为-1℃至18℃，BMSC仍保持其活力和基本功能不变。 国内杨鹏飞，杨宏伟等也分别进行了人体骨髓基质干细胞和角膜内皮细胞的冷冻干燥保存。说明海藻糖增强细胞干燥耐受性的作用，在复杂的真核细胞中同样可以实现。
