基本信息
- 项目名称：
- 花鳗鲡促性腺激素的基因克隆与酵母表达载体的构建
- 来源：
- 第十一届“挑战杯”国赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 本研究克隆了花鳗鲡促性腺激素（GTH）的3个亚基（GTHα、FSHβ、LHβ）基因的cDNA，GTHα cDNA全长362 bp，其中开放阅读框长351 bp，编码116个氨基酸，包括24个氨基酸的信号肽、92个氨基酸的的成熟肽。FSHβ cDNA全长458 bp，其中开放阅读框长384 bp，编码127个氨基酸，包括22个氨基酸的信号肽、105个氨基酸的的成熟肽。LHβ cDNA全长536 bp，其中开放阅读框长423 bp，编码140个氨基酸，包括24个氨基酸的信号肽、116个氨基酸的的成熟肽。组织分布研究表明GTHs除了在脑垂体有表达外，在性腺中也有较高的表达。Real-time PCR定量分析表明：脑垂体中GTHα和LHβmRNA水平在性腺发育成熟过程中不断升高，而FSHβmRNA水平在性腺发育早期较高，随着性腺发育成熟不断下降，说明FSH在性腺发育和配子发生的早期起主要作用，而LH主要是调控性腺发育的最后成熟。本研究还成功地构建了花鳗鲡GTHs的酵母表达载体，为今后表达出有生物活性的花鳗鲡促性腺激素，开展花鳗鲡神经内分泌学和人工繁殖研究奠定坚实的基础。
- 详细介绍：
- 本作品针对鳗鲡人工繁殖的世界性难题，结合我国鳗鲡养殖产业的发展，特别是海南近年来花鳗鲡养殖业迅速发展的实际需要，以我国名贵经济鱼类、二级保护动物——花鳗鲡为研究对象，以基因工程技术为切入口，克隆了GTHs亚基基因的cDNA，并分析了在性腺发育成熟过程中的表达特征以及生理功能，构建了花鳗鲡GTHs的酵母表达体系，在此基础上进行花鳗鲡人工诱导繁殖研究。研究结果表明：花鳗鲡促性腺激素的GTHα cDNA全长362 bp，其中开放阅读框长351 bp，编码116个氨基酸，包括24个氨基酸的信号肽、92个氨基酸的的成熟肽。FSHβ cDNA全长458 bp，其中开放阅读框长384 bp，编码127个氨基酸，包括22个氨基酸的信号肽、105个氨基酸的的成熟肽。LHβ cDNA全长536 bp，其中开放阅读框长423 bp，编码140个氨基酸，包括24个氨基酸的信号肽、116个氨基酸的的成熟肽。组织分布研究表明GTHs除了在脑垂体有表达外，在性腺中也有较高的表达。Real-time PCR定量分析表明：脑垂体中GTHα和LHβmRNA水平在性腺发育成熟过程中不断升高，而FSHβmRNA水平在性腺发育早期较高，随着性腺发育成熟不断下降，说明FSH在性腺发育和配子发生的早期起主要作用，而LH主要是调控性腺发育的最后成熟。本研究还成功地构建了花鳗鲡GTHs的酵母表达载体，为今后表达出有生物活性的花鳗鲡促性腺激素，开展花鳗鲡神经内分泌学和人工繁殖研究奠定坚实的基础。
作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 本作品以我国二级保护野生动物—花鳗鲡为研究对象，通过克隆花鳗鲡的促性腺激素（GTHs）基因的cDNA，研究这些基因在其14种组织器官中表达情况；并研究GTHs在其性腺发育不同阶段的mRNA表达特征，初步了解GTHs在花鳗鲡性腺发育与成熟过程中的生理功能；同时采用基因重组技术，构建了GTHs的酵母表达载体，以表达出有生物活性的花鳗鲡促性腺激素，为鳗鲡人工繁殖提供新型的催熟催产剂。
科学性、先进性及独特之处
- 鳗鲡人工繁殖是世界性难题。成功地开展鳗鲡人工繁殖的关键之一是要有高效的催熟催产剂，以保证获得高质量的精子和卵子，从而提高受精率、孵化率和仔鱼存活率。GTHs是调控鱼类性腺发育与成熟的关键性内分泌因子。本作品采用酵母表达体系表达酵母表达花鳗鲡GTHs，不仅在技术方法上先进；而且，表达产物是花鳗鲡的生殖内分泌因子中的重要因子，对于解决鳗鲡的人工繁殖问题有重要的理论指导意义和应用价值。
应用价值和现实意义
- 本作品通过克隆花鳗鲡的促性腺激素（GTHs）基因的cDNA，初步探讨了GTHs在花鳗鲡性腺发育与成熟过程中的生理功能；并构建了酵母表达体系，为下一步促性腺激素的重组表达打下基础。获得具有生物活性的花鳗鲡GTHs，不仅可用于花鳗鲡的生殖内分泌学和人工繁殖研究，为解决鳗鲡人工繁殖问题提供基础；也可利用于其他鱼类的人工繁殖生产应用，可作为新一代的鱼类催熟催产剂，具有良好的应用前景。
学术论文摘要
- 克隆了花鳗鲡促性腺激素GTHs的3个亚基（GTHα、FSHβ、LHβ）基因的cDNA，GTHα cDNA全长362bp，其中开放阅读框长351bp，编码116个氨基酸，包括24个氨基酸的信号肽、92个氨基酸的的成熟肽。FSHβ cDNA全长458bp，其中开放阅读框长384bp，编码127个氨基酸，包括22个氨基酸的信号肽、105个氨基酸的的成熟肽。LHβ cDNA全长536bp，其中开放阅读框长423bp，编码140个氨基酸，包括24个氨基酸的信号肽、116个氨基酸的的成熟肽。通过Real-time PCR定量分析表明：花鳗鲡脑垂体中GTHα和LHβ mRNA水平在性腺发育成熟过程中不断升高，而FSHβ mRNA水平在性腺发育早期较高，随着性腺发育成熟不断下降，说明FSH在性腺发育和配子发生的早期起主要作用，而LH主要是调控性腺发育的最后成熟。最后成功地构建了花鳗鲡GTHs的酵母表达载体，为下一步GTHs的重组表达研究奠定了基础。
获奖情况
- 该作品于2009年5月获得某校“挑战杯”大学生学术科技作品竞赛特等奖。
鉴定结果
参考文献
- [1]袁瑛,闵志勇.花鳗鲡的基础生物学研究[J].水产科学,2005,24(9):29-31. [2]Kagawa et al. The first success of glass eel production in the world: basic biology on fish reproduction advances new applied technology in aquaculture[J]. Fish.Physiol.Biochem.,2005,31:193-199. [3]Hayakawa et al. Induction of spermatogenesis in Japanese eel by recombinant goldfish gonadotropins[J]. Fish.Sci.,2009,75:137-144. [4]Kamei et al. Expression of a biologically active recombinant follicle stimulating hormone of Japanese Eel Anguilla japonica using methylotropic yeast[J],Pichia pastoris. Gen.Comp.Endocrinol.,2003,162:192-202. [5]孙红立等.毕赤酵母(Pichia pastoris) 分泌表达牛白细胞介素[J].中国兽医学报, 2004, 24(3):261-267.
同类课题研究水平概述
- 促性腺激素（GTH）是促进性腺发育成熟的关键性激素。GTH是由2个亚基（GTH-a、GTH-β）组成的糖蛋白激素：促卵泡激素（FSH）由GTH-a与FSH-β亚基组成，促黄体激素（LH）由GTH-a与LH-β亚基组成。与其他脊椎动物一样，鱼类的繁殖活动受到脑-垂体-性腺轴的调控。下丘脑产生的促性腺激素释放激素刺激二种类型的促性腺激素（FSH、LH）的合成与分泌；促性腺激素作用于性腺产生性类固醇激素，进而调节性腺的发育成熟。 在养殖条件下，鳗鲡由于缺乏适合的生态环境，促性腺释放激素和促性腺激素未能充分分泌和发挥作用，使得性腺发育成熟、排卵、排精等生理过程无法完成。注射鱼类脑垂体或HCG已经被成功用于诱导日本鳗鲡和欧洲鳗鲡的性腺发育成熟和产卵，但结果还不理想。这可能和这些异源促性腺激素不能完全代替同源促性腺激素的生理作用，造成性腺发育与成熟异常有关。如何获得充足的同种鳗鱼促性腺激素来诱导鳗鱼性腺发育成熟与产卵是解决鳗鲡人工繁殖的关键之一。基因重组技术和蛋白表达技术的快速发展使得表达各种鱼类的促性腺激素并用来代替鲤鱼脑垂体提取物已经成为可能。在国外，鱼类的促性腺激素基因重组表达已在几种表达体系中成功表达；但在国内还没有研究报道。 花鳗鲡是我国名贵的经济鱼类之一，其营养价值高，市场价格是日本鳗鲡、欧洲鳗鲡的3倍，而且市场需求大，养殖产业发展前景好。但花鳗鲡自然资源匮乏，又是国家保护动物。当前花鳗鲡的养殖苗种完全依赖于捕捞天然苗种，不仅会严重影响花鳗养殖业的健康持续发展，而且对花鳗鲡自然资源的保护与合理利用也会造成极大威胁。因此，开展花鳗鲡人工繁育研究势在必行，但至今未见有关花鳗鲡生殖内分泌调控的研究报道。根据日本鳗鲡人工繁殖研究取得的成果和经验，解决花鳗鲡的人工繁育问题首先要了解花鳗鲡神经生殖内分泌学的特点，尤其是促性腺激素的作用特点与调控机制，然后设计科学合理的技术方案，采用有活性的同源促性腺激素诱导花鳗鲡性腺发育成熟与产卵。因此，本研究在国内外首次提出用基因重组表达的花鳗鲡促性腺激素来诱导花鳗鲡性腺发育成熟。首先克隆了花鳗鲡促性腺激素基因cDNA，并对其组织分布与生理功能做了初步研究，还建立花鳗鲡促性腺激素酵母表达体系，为今后开展花鳗鲡的神经内分泌学和人工繁殖奠定基础。总的来看，本作品的研究成果既具有较高的理论价值，又有很好的生产应用前景。
