基本信息
- 项目名称：
- 病源微生物稻瘟菌激发子几丁质酶与受体甘露糖凝集素互作研究
- 来源：
- 第十一届“挑战杯”国赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 水稻是世界三大粮食作物之一，同时作为我国主要的粮食作物，却深受稻瘟病的危害，稻瘟病是限制水稻高产稳产的主要因素。对稻瘟菌的发病机制进行研究具有重要意义，同时对稻瘟病的防治也一直是研究的重点和难点。本研究利用酵母双杂交系统筛选到与稻瘟病菌激发子（几丁质酶）互作的受体。通过体外的GST沉淀验证相互作用的特异性。再将阳性克隆子测序，通过生物信息学来预测受体蛋白的结构以及结构和功能之间的关系。最后通过生物学功能分析来明确激发子蛋白与受体蛋白的结构与功能的互作关系。从而揭示水稻与稻瘟病菌相互作用的分子机制，把寄主-病源物相互识别的研究推向一个新的阶段。
- 详细介绍：
- 本研究利用酵母双杂交系统以稻瘟菌激发子(几丁质酶)作为诱饵蛋白，从水稻cDNA文库中筛选到激发子受体。把诱饵蛋白几丁质酶基因与含有His的表达载体pET-32a构建重组载体，把受体蛋白基因与含有GST的表达载体pGEX-KG构建重组载体。验证重组载体构建成功后，诱导其表达蛋白，收集诱饵蛋白几丁质酶和靶蛋白甘露糖凝集素，通过GST pull down来验证激发子与受体蛋白相互作用的特异性。在体外验证它们确实存在互作后，对受体进行生物学分析，构建不同的突变体来进一步明确激发子蛋白与受体蛋白的互作关系。根据糖结合位点的位置构建了带有GST标签的四个不同突变体，突变体构建成功后，诱导其表达蛋白，收集并纯化蛋白，分别与几丁质酶进行GST pull down ，收集洗脱液进行Western Blotting检测。分析实验数据后，结果发现受体83-94位间的糖结合位点在甘露糖凝集素与稻瘟菌几丁质酶互作中起着关键作用，而其他两个糖结合位点都不是必须的，但可能起辅助作用。本实验得出的结论对弄清激发子与受体间的互作关系，揭示水稻与稻瘟病菌相互作用的分子机制具有重要意义，同时也可以为利用这些基因进行水稻转基因抗病育种奠定基础，对于水稻抗病品种的改良和新型高效、无公害生物农药的研制也将提供可靠的理论依据。
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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 目的：植物病源微生物激发子及其受体的研究是一个新领域，开展激发子受体的研究工作，有助于深入了解稻瘟菌—水稻间的相互识别，阐明水稻对稻瘟病菌的抗性机制和水稻与稻瘟病菌互作的分子机理。 基本思路：本研究通过酵母双杂交筛选稻瘟菌激发子的受体，通过体外的GST pull down进一步验证激发子与受体的互作。通过生物信息学分析受体的结构。在生物信息分析的基础上，进一步研究受体与激发子互作的分子机制。
科学性、先进性及独特之处
- 科学性、先进性：本研究在筛选到受体后还进一步从体外对筛选到的受体进行验证，且充分利用了生物信息学的知识对受体进行分析，且构建不同突变体进一步研究激发子与受体互作的分子机制。该作品取得的实验结果，通过联网检索，未见相同报道。 独特之处：在水稻和稻瘟菌全基因测序完成的基础之上，全面地分析受体蛋白结构及其生物学功能，明确其互作关系。未见相同报道。
应用价值和现实意义
- 该作品的结果可以初步揭示水稻与稻瘟病菌相互作用的分子机制，为稻瘟病的生物学防治奠定基础，把寄主—病源物相互识别的研究推向一个新的阶段。同时也可以为利用这些基因进行水稻转基因抗病育种奠定基础，对于水稻抗病品种的改良和新型高效、无公害生物农药的研制也将提供可靠的理论依据。
学术论文摘要
- 意义：病源微生物激发子与受体相互作用的研究，有助于弄清病原微生物侵染宿主的分子机制。思路：用稻瘟病几丁质酶作为病源微生物激发子，利用酵母双杂交系统筛选与稻瘟病菌激发子互作的受体，并研究受体的功能。实验路线：利用酵母双杂交系统以稻瘟菌激发子作为诱饵蛋白，从实验室构建的水稻的cDNA文库中筛选激发子受体，先把诱饵蛋白几丁质酶与含有His表达载体pET-32a进行融合表达，把受体蛋白与含有谷胱甘肽转移酶(GST)的表达载体pGEX-KG进行融合表达。构建好载体后分别诱导表达含有这种亲合标签的融合蛋白，进行GST pull down 验证相互作用的特异性。最后对受体进行生物信息学分析，构建不同的受体突变体来明确激发子蛋白与受体蛋白的结构与功能的互作关系。结果：筛选到稻瘟菌几丁质酶的一个受体-甘露糖凝集素(Osmbl)，并体外验证它们存在互作，且通过生物信息学对受体进行分析，并构建了四个不同突变体，诱导表达蛋白进行GST pull down，结果发现了受体83-94位间的糖结合位点在甘露糖凝集素与稻瘟菌几丁质酶互作中起着关键作用，而其他两个糖结合位点都不是必须，但可能起辅助作用。
获奖情况
- 2008年入选校级大学生创新性实验计划项目 2008年入选省级大学生创新性实验计划项目 2009年获“挑战杯”省级大学生课外学术科技作品竞赛“特等奖”
鉴定结果
参考文献
- 酵母双杂交技术、GST pull-down、Western blotting、分子克隆技术等。 [1] Willy J, et a1．Analysis of the sugar-binding specificity of mannose-binding-type Jacalin-related lectins by frontal affinity chromatography – an approach to functional classification.The FEBS Journal 275 (2008) 1227–1239. [2] Abel Garcia-Pino, et al． How a Plant Lectin Recognizes High Mannose Oligosaccharides.Plant Physiology, August 2007, Vol. 144, pp. 1733–1741. [3] Jun Fang, et al．Mutations of genes in synthesis of the carotenoid precursors of ABA lead to pre-harvest sprouting and photo-oxidation in rice.The Plant Journal (2008) 54, 177–189. [4] Xinai Zhao, et al．OsTDL1A binds to the LRR domain of rice receptor kinase MSP1, and is required to limit sporocyte numbers.The Plant Journal (2008) 54, 375–387.
同类课题研究水平概述
- 已证实寡糖、几丁质、糖蛋白、蛋白质和不饱和脂肪酸等在水稻与稻瘟病菌互作关系中具有激发子的活性。在稻瘟病菌中，已经克隆MPG1、CUT1、Avr-pita、PWL2等十几个致病性基因和无毒基因。MPG1基因是第一个被克隆的稻瘟病菌致病因子，其产物与细胞表面识别有关。CUT1基因编码某种角质酶，与菌丝穿透寄主角质层有关。Sweigard等利用定位法从稻瘟病菌（Guy 11）中克隆了无毒基因PWL2，该基因与对弯叶画眉草（Eragrostis curvula）的致病性相关。Kanoh等从稻瘟病菌中分离纯化了一种25 kDa的糖蛋白激发子，可诱导O2－的产生；而Schaffrath等所分离纯化的另一种15.6 kDa的糖蛋白激发子，则可诱导木质素的产生。国内华南农业大学报道，从稻瘟菌细胞壁中分离到的水溶性激发子GP66，可诱导水稻叶片过氧化物酶与苯丙氨酸解氨酶活性增强；随后又从稻瘟病菌菌株97-151a细胞壁中分离纯化出水溶性的糖蛋白CSBI，具有诱导水稻重要防御酶活性的激发子功能。 目前，在植物与病原菌互作系统中已发现了许多蛋白类激发子，Chan等从稻瘟菌侵染的cDNA文库中克隆到与诱导水稻产生防卫反应有关的Oschib1基因，该基因可能是与水稻致病相关的蛋白8家族的成员之一。Takashi等从稻瘟菌附着胞的消减cDNA文库中发现某一新的芽管特异基因CBP1，推测其编码一种胞外几丁质酶，且可能与附着胞表面疏水性有关。Giaver等从酿酒酵母中克隆到与孢子的形成有关的几丁质酶基因，其缺失会导致孢子壁、成熟的子囊无法形成。Liu等发现具有很强的抗真菌活性的几丁质内切酶基因ech42。 本作品筛选到激发子（几丁质酶）的受体（甘露糖凝集素），及其受体互作的研究，未见相同报道。
