基本信息
- 项目名称：
- 基于代谢组学新方法调控新型功能因子花生四烯酸高效生物合成
- 来源：
- 第十一届“挑战杯”国赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 花生四烯酸（Arachidonic acid，简称ARA，即5,8,11,14-二十碳四烯酸）是一种重要的长链多不饱和脂肪酸（PUFAs），广泛应用于功能保健、生物医药、化妆品及饲料添加剂等方面。在发酵生产花生四烯酸的菌种之中，高山被孢霉（M. alpina ）被认为是最优良的菌种，但其属于基因背景不清楚，代谢网络复杂的工业微生物，利用传统的代谢工程和基因工程方法来解决此类微生物发酵问题具有一定复杂性和局限性。而新发展起来的代谢组学则能够搭建微生物微观信息和宏观表型的桥梁，从而解决工业微生物发酵的关键问题。 本作品以实验室筛选的三株ARA高产菌株M. alpina为研究对象，利用代谢组学新方法获取在ARA生产过程中与产量和菌体生物量相关的小分子代谢物，并将其作为调控因子调控ARA的高效生物合成，使ARA在总脂肪酸中的含量由调控前的56.2% 增大到调控后的75%，ARA含量高达19.8g/l，达到国际领先水平。该代谢组学新方法为其它基因背景不清晰、代谢途径复杂的工业微生物的代谢调控提供了一种简单快速、可控高效的思路和手段。 目前，本作品中涉及的ARA生产与调控方法已与江苏天凯生物科技有限公司合作，进入产业化中试阶段，该技术方法增强了与国外ARA生产技术的竞争力，为摆脱国内奶制品和制药等行业对国外高品质ARA供应商的依赖具有重要意义。
- 详细介绍：
- 工业微生物大多基因背景不清晰，合成目标产物代谢途径复杂，对其代谢途径关键酶调控机制以及微生物基因型和代谢功能表型之间的关系缺乏分子水平上认识，对途径中某个或多个酶进行调控，往往不能实现预期的效果，而代谢组学的生化水平表征最接近于细胞功能状态的反映，因此利用代谢组学来全面理解微生物生理功能是最有效的。花生四烯酸（ARA）是一种重要多不饱和脂肪酸（PUFAs）,对人的生理活动起着十分重要的作用，被誉为新一代功能保健因子。 本作品以花生四烯酸（ARA）高产菌株M.alpina为研究对象，针对该工业微生物发酵中的共性问题，提出代谢组学的研究方法，搭建微生物微观代谢信息和宏观发酵调控的桥梁，以实现目标产物的高产。 本作品以实验室诱变筛选得到的三株高产花生四烯酸的M. alpina菌株（Y1，Y2，Y3）为研究对象，通过三个层次分析出代谢产物中与目标产物积累相关的小分子，并将其作为调控因子进行研究分析，以促使ARA在M.alpina中高效合成。 1、基于代谢组学的代谢组信息获取 在代谢组学研究过程中，样品制备是其中第一步也是最关键的环节，代谢产物是否能够实时的、准确的、全面的获得关系到后续分析及数据处理后得出的代谢产物及生命特征的相关性是否可靠。为获得具有代表性的样品，分析时的样品的代谢组成分必须保证与取样时一致，才能反应样品当时的代谢活动，因此这一反映特定生理状态的代谢状态必须要被“固定”住（代谢淬火），直到分析完成，这是取样的关键环节。基于不同菌种的细胞壁结构不同，对渗透压的耐受程度不同以及膜的通透性差异的考虑，本作品设计三种淬火方案：甲醇淬火、液氮淬火、液氮淬火与研磨，并从中筛选出最优的淬火方案。 2、基于三株高产菌代谢组差异的主成分确定 通过对三株高产菌株的GC-MS图谱进行对比分析不同菌株的代谢异同，找出了高产菌株中的18种共有代谢产物，采用主成分分析法对共有代谢物进行归类分析，得到两个主成分。一个指向细胞生长的主成分，其指标物包括胱氨酸，没食子酸，天冬酰胺，葡萄糖，缬氨酸，丁酸；一个指向ARA合成的主成分其指标物包括前列腺素、赖氨酸、蝶啶、丁醇、甘氨酸、半乳糖、乙酸、棕榈酸、硬脂酸。同时也大致确定了胞内代谢物与生物质及ARA单产水平的关系，并以从中筛选出的指标物作为调控因子，此代谢组学的分析方法为发酵调控提供了新的角度。 3、基于刺激-响应的代谢调控 本作品利用由代谢组学分析得到的与目标产物产量相关的小分子物质作为调控因子，在发酵产ARA的过程中，在发酵的不同阶段探索性的添加赖氨酸、没食子酸和乙酸三种目标产物相关因子，同时考虑到发酵后期碳源的耗尽，为实现更好的调控性能，本作品在发酵后期流加了葡萄糖。结果显示：没食子酸的添加主要影响了生物量的积累，最高的生物量为41.3g/L，乙酸的添加对生物量和ARA含量的影响不确定，赖氨酸的添加使ARA的含量不断增加，在发酵后期使得ARA在总脂肪酸的含量由调控前的56.2% 增大到75%,此时ARA含量为19.8g/l，达到国际领先水平。实验结果论证了代谢组学在工业微生物的发酵调控中的有效性。 本作品利用代谢组学新方法调控M. alpine 发酵，实现了高产ARA。已与江苏天凯生物科技有限公司合作，进入产业化试用阶段。代谢组学在M. alpine发酵产花生四烯酸的成功应用为从根本上解决微生物油脂积累的技术难题提供了新的视角和手段，也为从代谢组学层次进一步提升ARA发酵生产能力提供了理论依据和方法指导，有利于增强对微生物细胞代谢调控理解和认识，推动工业生物技术的发展。
作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 高山被孢霉是发酵合成花生四烯酸（ARA）最高的工业微生物，基于基因和代谢工程的传统调控方法存在一定局限性，因此寻求新的平台搭建微生物微观信息和宏观表型的桥梁是解决工业微生物发酵问题的关键。本作品利用代谢组学对ARA合成过程中代谢产物的分析，寻找与ARA产量相关的小分子，并选取一部分作为调控因子，考察不同添加时间下的生物量、ARA含量，获得最优的添加方案，进而实现ARA在高山被孢霉中的高效合成。
科学性、先进性及独特之处
- 本作品利用高通量代谢组学的方法跳过了基因操作的壁垒，较为全面地解析代谢产物，分析出和目标产物相关的调控因子，提出了有针对进行代谢调控的思路；针对传统调控单个节点有效性差、局限性过多等缺点，提出了一个针对高山被孢霉的全新研究思路: 利用代谢组学的研究方法得到与ARA产量相关小分子，然后针对该小分子定向调控使ARA在高山被孢霉体内高效合成，为代谢途径复杂的微生物的代谢调控提供了一种可控、高效的方法。
应用价值和现实意义
- 作品用代谢组学新方法调控高山被孢霉使ARA发酵达到世界领先水平，增强了ARA与国外生产技术的竞争力，并与江苏天凯生物科技有限公司合作，进入产业化试用阶段。为从根本上解决微生物油脂积累的技术难题提供新的视角和手段，也从代谢组学层次提升ARA发酵生产能力提供方法指导，为基因背景不清晰，代谢网络复杂的微生物代谢调控的研究提供了新的思路，有利于增强对微生物细胞代谢调控理解和认识，推动工业生物技术的发展。
学术论文摘要
- 花生四烯酸（ARA）是一种重要多不饱和脂肪酸（PUFAs）,对人的生理活动起着十分重要的作用，被誉为新一代功能保健因子。本作品以花生四烯酸（ARA）生产菌高山被孢霉（M. alpina）为研究对象，通过对相同培养条件下不同菌株的代谢产物进行分析，完善代谢产物提取方法，优化数据处理，快捷获取数据信息，寻找出与ARA产量相关的共性小分子代谢物，将其作为调控因子，最终发现没食子酸的添加主要影响了生物量的积累最高的生物量为41.3g/L，乙酸的添加对生物量和ARA含量的影响不确定，赖氨酸的添加使ARA的含量不断增加，在发酵后期使得ARA在总脂肪酸中的含量由调控前的56.2% 增大到75%,此时ARA含量达到19.8g/L，是已有文献报道的最高值。
获奖情况
- 无
鉴定结果
- 无
参考文献
- [1] Villas-Boas SG, Rasmussen S. Metabolomics or metabolite profiles. Trends in Biotechnology, 2005, 23: 385-386. [2] Villas-Boas SG, et al Metabolomics or metabolite profiles. Trends in Biotechnology, 2005, 23: 385-386 [3] Blow N. Metabolomics:Biochemistry's new look. Nature, 2008, 455: 697-700.
同类课题研究水平概述
- 据文献报道，低等真菌特别是被孢霉属中的Mortierella亚属真菌体内含有大量的ARA，如：高山被孢霉、长被孢霉、深黄被孢霉等，通过对50多种亚属分析，发现高山被孢霉的ARA产量最高。具体研究内容主要体现在以下几个方面： 分子机理方面：主要集中在ARA合成途径某一关键酶或基因的调控方面，而国内这方面的研究则很少。04年Sakuradani E.等通过筛选具有低n-3脱饱和酶活性的高山被孢霉突变株来提高ARA产率。05年Sakayu Shimizu从分子机理上说明高山被孢霉合成ARA的限速步骤主要是从C18:3到C20:3的延伸。国内周蓬蓬等在02年研究了己糖单磷酸途径在被孢霉生产ARA中的作用，并对葡萄糖-6-磷酸脱氢酶进行调控以促进ARA的积累。 生产方式分析：ARA发酵生产常用培养方式有分批式，连续式和流加式。05年Byung-Hae Hwang等在12L发酵罐中进行补料发酵培养高山被孢霉，每次间歇加入32g/L葡萄糖，14%(v/v) NH4OH， 最终ARA含量为18.8g/L，比分批发酵高1.8-4倍。 动力学分析：由于在同一时期菌体生长和油脂的合成不是平行的，国内对这方面进行了充分的研究，并建立了菌体生长和油脂形成、氮源与葡萄糖双底物限制动力学模型及合成ARA的代谢通量模型，实现了发酵碳流迁移，提高了发酵产量。虽然国内外对ARA发酵生产做了大量的研究工作，但由于合成ARA菌种基因背景不清晰、代谢途径复杂，单纯对代谢途径某个或多个酶或基因进行调控，往往不能实现预期的效果。代谢组学是应用现代分析方法对某生物或细胞在特定生理时期内所有相对分子质量较低的代谢产物进行定性和定量分析的一门新兴学科，自1998年提出后，其主要应用于医学和植物学等领域，近年来，逐渐向微生物领域渗透，也取得了一定的成果。 Werf MJ van der等利用多参数模式识别技术，分析整合全面的、动态的代谢反应信息用于瓶颈因素的无偏分析和排序，进行指导菌种改良和关键培养基组分的确定。但国内代谢组学用于微生物领域的报道比较少。 综上所述，代谢组学在基础科学领域提供了一种先进的理念，其最大的特点就是从表型着手回答其他组学不能回答的生物问题，因此利用代谢组学来全面理解微生物生理功能是最有效的，为基因背景不清晰、代谢途径复杂的微生物代谢调控的研究提供了新思路和新方法。
