基本信息
- 项目名称：
- GFP标记用于废水生物强化处理监测的研究
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 为了研究邻硝基苯甲醛（ONBA）高效降解菌ONBA-17的生物强化效果，追踪其在序批式反应器中的存活情况，本研究在实验室条件下，以ONBA-17为出发菌株，通过同源重组将gfp片段导入菌株染色体中，并进行遗传稳定性验证；通过监测SBR处理系统运行效果（SVI、COD和ONBA浓度）和标记菌株（ONBA-17gfp）的存活情况，证实标记菌株具备生物强化处理ONBA合成废水的能力。
- 详细介绍：
- 为了研究邻硝基苯甲醛（ONBA）高效降解菌ONBA-17的生物强化效果，追踪其在序批式反应器中的存活情况，本研究在实验室条件下，以ONBA-17为出发菌株，通过同源重组将gfp片段导入菌株染色体中；通过连续传代培养、荧光检测和PCR扩增检验插入gfp片段的遗传稳定性；通过监测SBR处理系统运行效果（SVI、COD和ONBA浓度）和标记菌株（ONBA-17gfp）的存活情况，证实标记菌株具备生物强化处理ONBA合成废水的能力。
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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 为了研究邻硝基苯甲醛（ONBA）高效降解菌ONBA-17的生物强化效果，追踪其在序批式反应器中的存活情况，本研究在实验室条件下，以ONBA-17为出发菌株，通过同源重组将gfp片段导入菌株染色体中，并进行遗传稳定性验证；通过监测SBR处理系统运行效果（SVI、COD和ONBA浓度）和标记菌株（ONBA-17gfp）的存活情况，证实标记菌株具备生物强化处理ONBA合成废水的能力。
科学性、先进性及独特之处
- 1、本研究将gfp片段插入供试菌株染色体上，与常规转质粒标记法相比遗传稳定性更佳； 2、运用激光共聚焦显微镜等实时监测手段，肯定了ONBA-17菌株的生物强化效果及其污染物去除能力，更为全面给出其生物强化效果评价； 3、将ONBA微生物降解研究由单一菌株分离和特性研究引深到SBR反应器废水生物强化处理小试研究，与实际应用更为贴近。
应用价值和现实意义
- 常规活性污泥法在处理特异性难降解污染物时，出水仍存在环境风险。生物强化作为一种有益且必要的辅助措施，被用于提升异生物质处理效果。本研究在实验室小试条件下证实了标记菌株具备生物强化处理ONBA废水的能力，为后续的中试和实际运用作了有益的铺垫。本研究将荧光标记、微生物降解和生物强化有机的结合在一起，对生物强化效果进行了分析，给出了影响接种物存活的主要因素，为后续研究进行了铺垫。
学术论文摘要
- 为了研究邻硝基苯甲醛（ONBA）高效降解菌ONBA-17的生物强化效果，追踪其在序批式反应器中的存活情况，同时加深对分子生物学的认知和增进分子标记实验相关技能，本研究以ONBA-17为出发菌株，通过同源重组和抗性平板筛选等手段，将gfp片段导入菌株染色体中。通过连续传代培养、荧光检测和PCR扩增检验插入gfp片段的遗传稳定性，证实其生长和降解特性较出发菌株无显著差异。通过监测SBR处理系统运行效果（SVI、COD和ONBA浓度）和标记菌株（ONBA-17gfp）存活情况，证实荧光标记菌株具备生物强化处理含ONBA合成废水的能力。
获奖情况
- GFP标记用于废水生物强化处理监测的研究相关内容《绿色荧光蛋白用于废水生物强化处理监测研究》，曾于2010年11月21日在浙江中医药大学参加由浙江省大学生科技竞赛委员会举办的2010年浙江省第二届大学生生命科学竞赛（Ⅰ类竞赛）中成功获奖。
鉴定结果
- 徐秋芳和叶正钱两位教授做了如下鉴定：该项目处于研究前沿、具有重大社会意义；将ONBA微生物降解的研究扩展到生物强化效果阶段；其实验操作严谨，数据严密，实验方案合理，大胆创新，结果正确。
参考文献
- [1] Chalfie M, Tu Y and Euskirchen G, et al. 1994. Green fluorescent protein as marker for gene expression [J]. Science, 263(5148): 802-805. [2] Olofsson A C, Zita A and Hermannsson M. 1998. Floc stability and adhesion of green fluorescent protein marked bacteria to flocs in activated sludge [J]. Microbiology, 144(2): 519-528. [3] 中华人民共和国国家统计局. 中国统计年鉴: 资源环境篇[M]. 北京: 中国统计出版社，2009. [4] 张俊杰，周宁一. 微生物降解芳烃污染物及其在生物修复和生物催化中的应用[J]. 中国基础科学, 2009, 11(5): 78-85. [5] Nüßlein K, Maris D and Timmis K, et al. 1992. Expression and transfer of engineered catabolic pathways harbored by Pseudomonas spp. introduced into activated sludge microcosms [J]. Applied and Environmental Microbiology, 58(10): 3380-3386. [6] Boon N, Goris J and de vos P, et al. 2000. Bioaugmentation of activated sludge by an indigenous 3-chloroaniline-degrading Comamonas testosteroni strain, I2gfp [J]. Applied and Environmental Microbiology, 66(7): 2906-2913.
同类课题研究水平概述
- 绿色荧光蛋白标记系统是研究生物膜上菌落特征和活性污泥菌群的有利手段。Skillman等人用GFP标记的Enterobacter agglomerans菌株和无标记的Kiebsiebla pneumoniae菌株混合培养16 h后，驯养生物膜，并使用碘化丙锭（Propidium Iodide, PI）进行染色（不掩盖GFP发出的荧光），以便在观测PI染色细胞的同时，监测GFP标记细菌的空间分布；Eberl等对Pseudomonas putida进行GFP标记，研究其在活性污泥中的存活情况，当P. putida接入活性污泥2 min之后，观察到细胞自由游动在淤泥絮凝物之间，培养3 d后，荧光细菌数开始减少，大部分定殖于絮凝物上；Olofsson等用GFP标记Escherichia coli和Serratiam arcescerns，并通过激光共聚焦显微镜实时监测菌体黏附污泥絮凝物的动态过程，发现菌体表面疏水性在附着过程中起重要作用，等等。为了增强对有机合成废水中某一类或某几类污染物的去除和转化效果，有必要在常规处理工艺基础之上实行强化处理。生物强化是通过向污染位点或反应器中投加野生型或基因工程菌来加速目标物质去除的一种有效且成本低廉的手段。如Ahring等人报道了接种混合菌群强化3-氯苯甲酸去除的研究。然而，从总体上看，有关邻硝基苯甲醛微生物降解的研究目前还主要停留在降解菌株分离、鉴定和特征研究阶段，其实际应用研究亟待深入。将GFP标记技术应用于废水生物强化处理监测具有一定的先进性。本实验将gfp片段插入供试菌株染色体上，与常规转质粒标记法相比遗传稳定性更佳；运用激光共聚焦显微镜实时监测等手段，肯定了生物强化效果和污染物去除能力，更为全面给出了生物强化的效果评估。 关于ONBA降解菌的研究，Yu Fang-Bo等通过富集培养和压力筛选，获得了具ONBA降解能力的恶臭假单胞菌和产碱杆菌各一株，对其降解特性、抗生素及重金属耐受能力等做了初步研究；Zhao等分离到一株具萘降解能力的P. putida ND6，该菌株中与萘降解有关的水杨醛脱氢酶NahV和NahF均能够催化ONBA的脱氢反应。随后其又在大肠杆菌中表达了nahV基因，对其酶学性质进行了研究，并发表相关论文。
