基本信息
- 项目名称：
- 油菜Ougra-cms恢复系的二重PCR体系的建立与应用
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- Ougra-CMS不育性稳定彻底，选育甘蓝型油菜Ougra-CMS的恢复系是油菜萝卜质雄性不育三系利用的重点。Ougra-CMS不育基因orf138和可育恢复基因orf687已经被克隆测序。本研究在普通PCR的基础上加以改进，建立了Ougra-CMS恢复系的二重分子标记辅助选择体系，提高Ougra-CMS恢复系的选择效率和准确性，促进Ougra-CMS杂交种的选育和广泛应用。
- 详细介绍：
- 利用细胞质雄性不育三系生产杂交油菜是提高油菜产量和改良菜籽品质最重要的途径。且要求不育系与恢复系选育简单易行，不育系育性稳定，杂种生产成本低。我国油菜生产上应用的CMS系以Polima-CMS 和陕2A-CMS不育系统为主，但两个不育系统在双低高含油量油菜杂种优势利用中受到较多限制，因此选择一种遗传稳定的细胞质不育系统用于油菜高含油量杂种选育很有必要。 Ougra-CMS首次报道于萝卜(Raphanus sativus)资源中(Ogura，1968)，其不育性稳定彻底，是由细胞质中线粒体嵌合基因orf138[1,2]和1对隐性细胞核基因（rfrf）共同控制[3]，被公认为是一种最稳定的不育材料，所有甘蓝型油菜品种均可以很好地保持其不育性，因而是转育双低高含油量油菜不育系的首选途径。但由于油菜品种中不存在Ogura-CMS系的恢复源，因此，选育甘蓝型油菜Ougra-CMS的恢复系就成为油菜萝卜质雄性不育三系利用的重点。Ougra-CMS不育基因orf138和可育恢复基因orf687已经被克隆测序[1]，这为利用其序列设计PCR引物进行恢复系的分子标记辅助选择奠定了基础。在CMS系统中，恢复系具有2种基因型，即S(RR)和N(RR)，其中基因型S(RR)在生产上具有较好的利用价值，更容易在杂交制种自繁中控制恢复系纯度。因此，常常选育具有不育细胞质类型的恢复系用于生产。 自1988年Chamberian 等率先提出[4]多重PCR(Multiplex Polymer -ase Chain Reaction, MPCR)这一概念以来，这一技术即得到普遍重视。MPCR是在同一反应体系中进行多个位点的特异性扩增，引物间的配对、引物间的竞争性扩增、反应的循环参数(包括退火温度、退火及延伸时间等)以及dNTP的用量等均会影响MPCR 的扩增效果。国外学者已先后开发了针对不同目标性状的多重PCR体系，大大提高了选择效率并节约了育种成本。本研究在普通PCR的基础上加以改进，在同一PCR反应体系里同时扩增不育基因orf138和恢复基因orf687，建立了Ougra-CMS恢复系的二重分子标记辅助选择体系，提高Ougra-CMS恢复系的选择效率和准确性，促进Ougra-CMS杂交种的选育和广泛应用。
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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 为加快油菜Ougra-cms杂交种选育，本研究根据已经报道的Ougra-cms不育和可育基因序列进行引物设计，建立和优化Ougra-cms恢复系的二重分子标记辅助选择PCR体系，并应用于不同恢复系改良后代的分子标记选择。降低选育成本，提高恢复系的选择效率。
科学性、先进性及独特之处
- 本研究是在PCR基础上，进行技术体系构建和应用，目的明确，科学性较强。该技术体系在同类作品中未见报道。二重PCR体系可以检测不同细胞质类型的恢复系。
应用价值和现实意义
- 本研究建立了Ougra-cms恢复系的分子标记辅助选择体系，在Ougra-cms恢复系的杂交改良中具有重要意义。
学术论文摘要
- 油菜Ougra-CMS是由细胞质中线粒体嵌合基因orf138和1对隐性细胞核基因（rfrf）共同控制的一种最稳定的雄性不育材料，是油菜杂种优势利用的一种有效途径。本研究根据不育基因orf138和恢复基因Orf687的基因序列，设计PCR特异引物，以自育的Ougra-CMS不育系、恢复系以及杂交F1代，建立相应的二重PCR体系，用于油菜Ougra-CMS恢复系的分子标记辅助选择。结果表明，建立的二重PCR体系用于F2代群体辅助选择，结果与常规测交结果吻合，提高了选择效率。本研究为油菜Ougra-CMS恢复系的选择提供了一种实用可靠的标记辅助选择技术体系。
获奖情况
- 无
鉴定结果
- 无
参考文献
- 1 Brown G G., Formanova N., Jin H., Wargachuk R., Dendy C., Patil P., Laforest M., Zhang J., Cheung WY and Landry BS.. The radish Rfo restorer gene of Ogura cytoplasmic male sterility encodes a protein with multiple pentatricopeptide repeats. Plant J, 2003, 35: 262-272 2 Desloire S., Gherbi H., Laloui W., Marhadour S., Clouet V., Cattolico L., Falentin C., Giancola S., Renard M., Budar F., Small I., Caboche M., Delourme R and Bendahmane A.. Identification of the fertility restoration locus, Rfo, in radish, as a member of the pentatricopeptide -repeat protein family. EMBO Rep，2003, 4:588-594 3 Chamberian J S.，Gibbs R A.，RRnier J E.. Detection screening of the duchenne muscular dystrophy locusvia multiplex DNA amplification．Nucl Acids Res，1988(16)：1141-1156 4 王关林，方宏筠．植物基因工程[M]．北京：科学出版社，1998
同类课题研究水平概述
- Ogura-CMS是通过种间有性杂交获得的，其细胞质和恢复基因都来源于萝卜，分别通过有性杂交和体细胞杂交转入油菜(Giancola et a1.,2003)。 Mats Hansen等（1997）年利用BSA（(bulked segregation analysis，BSA)法筛选出与油菜Ougra-cms恢复基因基因连锁的RAPD标记14个，并且其中包括可以筛选纯合恢复基因型植株的标记；Delourme等(1998)利用3个分离群体鉴定出与Ogura-CMS恢复基因完全连锁的4个RAPD标记，并将转移到甘蓝型油菜中带有恢复基因的萝卜染色体片段定位在第15连锁群上。Bartkowiak.Broda和Poplawska(1999)利用同工酶标记和RAPD标记进行辅助选择，获得了低硫苷及恢复基因纯合的植株，从根本上解决了甘蓝型油菜Ogu CMS恢复系的恢复基因与硫苷合成基因连锁的问题。在萝卜中有3个恢复基因RF1、RF2和RF3都能使Ogura不育胞质的育性恢复，Bett和Lydiate (2004)利用BC1、F2和一个有育性分离的随机交配群体中可育株自交后代群体R8等3个群体对这3个恢复基因进行定位，结果将RF1定位于Rs1连锁群的上部区域，RF2、RF3则分别定位在连锁群Rs2中部和Rs7的上部区域，3个恢复基因是不连锁的非等位基因。Brown等(2003)分别独立地利用图位克隆技术分离获得了一个序列相同的恢复基因，该基因编码一个687个 氨基酸的PPR蛋白，因此命名为orf687。Giancola S等人（2003）并导入油菜中的Ogura-CMS恢复基因Rf进行了测序和特性鉴定。Bonhomme 等(1991)年鉴定出与Ogura-CMS相关的不育基因序列orf138，Mari Iwabuchi等（1993）鉴定出kosena-CMS雄性不育基因orf125,是Ogura-CMS不育基因orf138的同源物。 Hu等（2008）基于双低油菜Ogura-CMS恢复系R2000开发出用于甘蓝型油菜萝卜质不育双低恢复系选育的PCR标记，并取得了较好的选择效果。然而，目前为止，未见有二重PCR体系同时筛选不同细胞质类型（不育细胞质或正常细胞质）的Ogura-CMS恢复系。本研究构建的二重PCR体系可以用于油菜Ogura-CMS恢复系改良后代群体的筛选。
