基本信息
- 项目名称：
- 氧化还原状态对正常肝细胞和肝癌细胞端粒酶活性
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 端粒，作为染色体末端的特殊结构，可以有效保护染色体末端的结构, 防止其降解、末端融合和重组。端粒酶可以调节端粒的长度，保护端粒的环状结构。细胞的氧化还原微环境对于端粒的长度、端粒酶的激活情况有很重要的调节作用。因此，研究端粒-端粒酶系统与细胞氧化还原微环境之间的关系对于揭示人类衰老、癌症的产生都具有重要的意义。
- 详细介绍：
- 2009年10瑞典皇家科学院宣布:诺贝尔医学奖授予杰克.少斯塔克,卡罗尔.格雷德及伊丽莎白.布莱克本以表彰三位科学家发现端粒和端粒酶是如何保护染色体的这一重要成就，从此，生命奥秘的研究又翻开新的一页。 端粒结构和功能 端粒是真核生物线形染色体末端的一种特殊结构, 由端粒和端粒蛋白质组成, 其端粒是富含G的高度保守的重复核昔酸序列，这种重复序列的碱基组成及长度因物种而异。不同物种的端粒序列不一致。人和其他哺乳动物的端粒由5’一3’方向的(TTAGGG)n反复串联组成, 在人类大约有5一15bp, 是非结构基因, 不具有编码蛋白质的功能[1]。 端粒的提出基于“末端复制问题”。正常细胞分裂中，染色体遵循半保留半不连续复制，这种方式在环状DNA的复制中表现的似乎完美，但在染色体线形DNA的复制中却存在着一些问题：①已知的DNA复制都需RNA引物的参与，其势必占据滞后链末端的一段DNA序列而使之无法复制；②DNA连接酶的作用是连接两条紧邻的冈崎片段，必须是两条紧邻的DNA片段才能被其催化形成磷酸二酯键，显然在滞后链的末端是不具备这个条件的. 这意味着在滞后链末端的一段DNA序列最终未被复制，或换句话说每次所复制的子代DNA都将较其亲本DNA丢失一段末端DNA序列（图1b）. 这也就是所谓的末端复制问题（End-replication problem）, 并随后为一系列实验所证实，所丢失的DNA序列长约50bp～100bp[2-6]。 于是，20世纪30年代末，诺贝尔奖金获得者Muller首先发现被X线打断的果蝇染色体末端极不稳定，因而提出染色体末端结构可能是为了维持染色体的稳定，并根据希腊文组词将其命名为端粒（Telomere）。 端粒可通过形成t-loop 紧凑结构[7]，或者与Shelterin 等端粒保护蛋白结合[8]，从而维护染色体的稳定, 防止染色体发生丢失、重组、末端融合和被酶消化降解等，进一步调节细胞生长．随着体细胞的不断增殖，端粒会逐渐缩短，当端粒缩短至一定程度，细胞停止分裂，进入静止状态，故有人称端粒为正常细胞的“分裂钟”(mistosis clock)。 端粒酶的结构和功能 端粒酶是一种核蛋白逆转录酶，在端粒受损时或缩短时能够延长其长度。在正常人体内，端粒酶的活性被抑制，胚胎干细胞中端粒酶高度表达。此外，肿瘤细胞中常常可以检测到较高活性的端粒酶。 本质上，它是一种核糖核蛋白．端粒酶通过引物特异识别位点，以自身RNA 为模板，在染色体末端合成端粒DNA，使端粒得以延长，为后续DNA 聚合酶合成完整的染色体提供了平台。 端粒-端粒酶与衰老和肿瘤的关系 1． 端粒缩短与衰老有着密切的关系 在此基础上，1989/1992年间Lundblad, Harley及Allsopp et al先后进行了一系列端粒短缩与细胞分裂次数及其衰老的相关性分析实验，并导致了“端粒假说”的提出[9-12]. “端粒假说”的核心内容认为：端粒随细胞分裂次数的增加而缩短，达到一定程度后启动某些信号，细胞停止分化并出现老化，即进入第一危机期（M1期）. 此时若细胞被病毒转化（如SV40T抗原），或者某些抑癌基因如P53, Rb等的突变，则有可能使细胞越过M1期继续分裂，端粒继续缩短，并最终进入第二危机期（M2期）. 此时染色体出现各种异常形态，细胞中某些端粒由于太短而失去功能，于是细胞死亡. 但极少数细胞在此阶段激活了端粒酶，使端粒功能得以恢复，则又可使细胞越过M2期并永生化. 2． 端粒酶的过度激活与肿瘤发生密切相关 端粒酶在胚胎发育时具有维持端粒长度，保护经常分裂的细胞的染色体完整性等功能。在成体体细胞中，端粒酶处于未被激活的状态。端粒随着每一次的细胞分裂，一次一次逐渐缩短，从而使细胞进入衰老过程。然而在癌细胞中，端粒酶则被激活，维持迅速分裂的细胞的端粒的长度，使其得以永生。由于端粒酶在癌症和衰老中起到重要的作用，它也成为了抗癌和抗衰老药物研究的重要靶点 端粒，端粒酶活性与氧化还原状态的关系 1． 氧化应激 氧化应激(oxidative stress)是指机体在遭受各种有害刺激,体内或细胞内自由基的产生与抗氧化防御之间严重失衡,氧化程度超出氧化物的清除,导致自由基如活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)在体内或细胞内蓄积而引起细胞毒性,从而导致组织损伤的过程[13]。氧化应激被认为是各种机体损伤的源头。 自由基又叫游离基, 是一类具有未配对电子的化学实体, 包括原子或原子团、分子或离子。机体内的自由基是物质氧化代谢伴随产生的瞬时中间体, 通过共价均裂、电子转移、加成反应、药物诱导等方式形成的。自由基的种类很多, 其中性质十分活泼的是活性氧。所谓活性氧是通过直接或间接方式形成的氧自由基及其衍生物。包括超氧阴离子自由基O2•- 、羟自由基〔•OH〕 、过氧化氢(H2O2)等。 细胞内的抗氧化系统可以有效降低体内自由基水平，以保护细胞免受氧化应激的侵害。抗氧化剂防护机制包括谷胱甘肽过氧化物酶类（GPX），谷胱甘肽还原酶，依赖于铜、锌的超氧化物歧化酶(SOD)1，过氧化氢酶以及依赖于锰的超氧化物歧化酶(SOD)2. 等。它们对于维持机体氧化还原平衡都起到了重要的作用。 2． 氧化应激与端粒-端粒酶活性 氧化应激与端粒-端粒酶活性有密切的关系。过强的氧化应激可以造成端粒DNA损伤并缩短端粒的长度；对于端粒酶的活性也有很大的影响。 研究发现，不同细胞株中端粒缩短的速率不同，且在不同的氧化还原状态下端粒缩短的速度也不尽相同。当成纤维细胞在高氧状态下或者亚毒性剂量的过氧化氢下其端粒缩短的速度将是正常条件下的5~10 倍。相反的，当使用抗氧化剂PBH或者维生素C干预时，其端粒缩短的速度将会降低一半左右[14]。数据显示，在基础条件下端粒缩短的速度约100bp/PD, 而在轻微高氧应激状态下约为600bp/PD. 但是在有效地抗氧化干预下端粒缩短的速度将低于15~20bp.以上研究充分说明并不是末端复制问题导致端粒缩短，而是氧化应激占了主导地位[14]。 大量活性氧介导DNA损伤不仅在正常人体中与细胞衰老密切相关，而且在肿瘤发生中尤其重要。DNA损伤引起突变，导致原癌基因被激活及抑癌基因的抑制，最终导致肿瘤的产生[15]。 此外，氧化应激对于端粒的作用，也可以通过对端粒酶活性的影响来实现。人类的端粒酶活性在胚胎细胞、干细胞以及大多数的肿瘤细胞中可以检测出来。在体细胞中，端粒酶则表达较少，大都检测不出来。端粒酶最近被发现有抵御氧化应激的作用。甚至有学者提出，保护细胞免受氧化应激的损伤才是端粒酶所起的主要作用，而非传统认为的维持端粒的长度[16]。 研究发现，端粒酶的催化亚基hTERT可以保护人的成纤维细胞，使之免受氧化应激的破坏。过表达的TERT，可以有效抵抗端粒的缩短，防止复制衰老[17]。 最近有研究发现，端粒酶在细胞内并不是固定不变的；不同的环境下，它会移动到不同的位置。在高氧化应激条件下，它会从细胞核中出来移动到线粒体中[18]。端粒酶在线粒体内，可以增强线粒体抵抗氧化应激的能力。 端粒酶的转移与氧化应激可能是一个相互的过程。高氧化应激情况下，细胞核运送TERT到线粒体中，并引起细胞衰老[19]。而转移到线粒体中的端粒酶则通过保护线粒体，提升细胞的抗氧化能力，从而延缓细胞衰老这一过程。但是，若端粒酶过度激活则会引发肿瘤。 总结已有文献报道的研究，我们发现，活性氧可以造成端粒的损伤，但适量的氧应激可以激活端粒酶而保护氧化应激对端粒造成的损伤，从而维持端粒长度，延缓细胞衰老；但是，若端粒酶过度激活却导致肿瘤的发生。 3． 抗氧化剂与端粒-端粒酶活性 抗氧化剂的作用基本上是通过对抗氧化应激对细胞造成的损伤来实现的。表现在端粒，端粒酶上，抗氧化剂可以帮助维持端粒的长度，对于抵御衰老有一定的作用。已经有很多实验证明抗氧化剂防止端粒缩短的作用。 正常细胞中，抗氧化剂维持端粒酶的活性，防止端粒缩短，抑制细胞衰老。研究发现维生素C抗氧化成分Asc2P 可以防止人血管内皮细胞端粒酶活性的减弱[20]。在人肝细胞L-02培养基中加入适当浓度有抗氧化作用含硒化合物, 发现端粒酶活性和hTERT基因表达水平显著性增高, 且呈一定的剂量-效应关系[21]。类似的，用抗氧化剂干预酿酒酵母细胞，检测到细胞端粒相对于对照组的延长，端粒酶活性增加[22]。含有抗氧化成分的白首乌C21甾苷（C21 steroidal glycoside，CSG）可以提高心脏组织中的端粒酶活性[23]。因此，正常细胞中，抗氧化剂通过促进端粒酶的活性，可以有效的防止端粒的缩短。 癌细胞中，抗氧化剂所表现出的却是抑制端粒酶的活性。它可以防止细胞端粒继续延长，促进癌细胞的衰亡。¬¬¬¬¬已由多个实验对此进行了证实。抗氧化剂二氧化硒通过抑制端粒酶活性、诱导细胞凋亡而抑制肺腺癌细胞株GLC一82细胞的生长．其抑制作用具有时效性和量效性[24]。有抗氧化作用的丁酸钠和阿霉素可以抑制宫颈癌Hela细胞增殖，联合应用具有协同效应。此效应与抑制端粒酶活性、下调hTERTmRNA表达有关[25]。 黎丹戎 et al[26]的体外实验证明了经典的抗氧化剂茶多酚在一定浓度下能诱导肝癌BEL-7404细胞凋亡，其抗癌机制与抑制端粒酶活性有关。小剂量维生素C能增强As2 O 3 诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡，并能增强As2 O3 对细胞内端粒酶活性的抑制作用[27]。 图：正常细胞中抗氧化剂与端粒-端粒酶。箭头表示促进，T形线表示抑制。 图：ROS诱导肿瘤细胞产生及抗氧化剂的作用。ROS可以使端粒缩短，当缩短到一定阈值之后， 在一些细胞中，端粒酶激活，维持细胞端粒长度。端粒酶的过量表达则会使细胞永生化，甚至 诱发肿瘤。在这一过程中，抗氧化剂的作用，根据往前的研究，我们推测抗氧化剂起到了抑制 端粒酶的作用。 由此我们看出，抗氧化剂对正常细胞和肿瘤细胞中端粒-端粒酶活性的作用是不同的。正常细胞中，抗氧化剂可以通过促进端粒酶活性从而延缓端粒缩短，而肿瘤细胞中抗氧化剂却是通过抑制端粒酶活性而抑制肿瘤。端粒酶在正常细胞和肿瘤细胞中对抗氧化剂反应不同的原因尚不清楚。因此，研究端粒、端粒酶系统与细胞氧化还原微环境之间的关系对于抗衰老和防止癌症有着重要的意义。 结语与课题的提出： 为什么自由基和抗氧化剂对正常细胞和肿瘤细胞会出现不同的应答？基于导师课题组原有的研究发现：首先，正常细胞和肿瘤细胞中氧化还原状态不同，通过ESR技术检测细胞中ROS发现，肿瘤细胞为阳性，正常细胞为阴性。肿瘤细胞的活性氧水平比正常细胞显著增高。其次，肿瘤细胞的增殖是依赖于活性氧的，活性氧可通过AKT等途径上调肿瘤细胞中糖酵解等能量代谢通路，保证肿瘤特异的能量供应。因此，我们推测活性氧对细胞端粒酶具不同的作用机制可能也与细胞氧化还原状态不同有关。对于不同的细胞，有着不同的细胞氧化还原水平的承受范围。相应的也就有某一阈值存在。在这一阈值范围内，端粒酶维持细胞长度，防止细胞衰老同时也不会促使细胞永生化。超过这一阈值，端粒酶激活过度，细胞步入永生化。抗氧化剂在癌细胞与正常细胞中所表现出的不同作用（癌细胞中抑制端粒酶活性；正常细胞中提高端粒酶活性）也可能与端粒-端粒酶活性承受氧化应激的阈值相关。我们希望本课题可以证明这一观点。研究二者相互作用机制对于人类的健康与长寿的潜在意义也是无限的。 因此本项目拟通过同时改变正常细胞和肿瘤细胞中氧化还原状态探讨其对端粒-端粒酶活性的影响。
作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 课题目的：探究氧应激和抗氧化干预对正常细胞和肿瘤细胞中端粒-端粒酶活性不同的作用机制。 1．课题背景 （1）端粒结构和功能 （2）端粒酶的结构和功能 （3）端粒-端粒酶与衰老和肿瘤的关系 （4）端粒-端粒酶活性与氧化还原状态的关系 （5） 结语与课题的提出 2． 实验设计和思路 3． 实验结果与分析
科学性、先进性及独特之处
- 【课题创新点】 1．目前少有研究通过对氧化还原状态进行干预来调控端粒-端粒酶活性。本课题通过外源性氧化剂和抗氧化剂对人正常肝细胞和人肝癌细胞进行干预，探讨其端粒酶活性的相应变化，尝试探索抗衰老和治疗肿瘤的新途径，为临床治疗提供新思路。 2．本课题涉及人肝癌细胞和人正常肝细胞，同时采取抗氧化和氧化两方面干预，尝试阐明氧化还原状态是端粒-端粒酶活性的重要调控途径。
应用价值和现实意义
- 【课题意义】 1.本课题研究结果有望指导临床，通过恰当改变氧化还原状态调控端粒-端粒酶活性、达到延缓衰老，治疗肿瘤，并为治疗衰老性疾病提供理论依据。 2.其结果有望为临床中针对不同个体其体内氧化还原微环境的水平提供个性化治疗提供理论依据，对延缓衰老，防治肿瘤的方案选择有重要指导意义，避免在治疗肿瘤的同时加快组织的衰老，在预防衰老的过程中诱发肿瘤。
学术论文摘要
- 端粒-端粒酶系统对于细胞的繁殖与生长有着重要的作用。端粒，作为染色体末端的特殊结构，可以有效保护染色体末端的结构, 防止其降解、末端融合和重组。端粒酶可以调节端粒的长度，保护端粒的环状结构。端粒的维持可以延缓衰老；端粒酶的过度激活可导致永生性细胞的产生，诱发肿瘤。此外，细胞的氧化还原微环境对于端粒的长度、端粒酶的激活情况有很重要的调节作用。细胞不同的氧化还原水平对端粒-端粒酶系统有不同的影响。已有不少研究发现氧化应激促使端粒缩短，加速细胞死亡。端粒酶可以抵御氧化应激，防止细胞受到损害。同时氧化应激也可以导致端粒酶的激活，增加了肿瘤细胞产生的概率。因此，研究端粒-端粒酶系统与细胞氧化还原微环境之间的关系对于揭示人类衰老、癌症的产生都具有重要的意义。
获奖情况
- 暂无
鉴定结果
- 无
参考文献
- [1]氧化应激、端粒长度与衰老.宗峰。国外医学.老年医学分册。2003年7 月第24卷第4 期，151-154 [2] Bryan TM, Cech TR. Telomerase and the maintenance of chromosome ends. Curr Opin Cell Biol, 1999;11:318-324 [3] Collins K. Mammalian telomeres and telomerase. Curr Opin Cell Biol, 2000;12:378-383 [4] Mckenzie KE, Umbricht CB, Sukumar S. Applications of telomerase research in the fight against cancer. Mol Med Today, 1999;5:114-122
同类课题研究水平概述
- 氧化应激对于端粒的作用，也可以通过对端粒酶活性的影响来实现。人类的端粒酶活性在胚胎细胞、干细胞以及大多数的肿瘤细胞中可以检测出来。在体细胞中，端粒酶则表达较少，大都检测不出来。氧化应激在内皮细胞；血管平滑肌细胞白血病癌细胞中，均有效的降低了端粒酶的活性，并加速了端粒的缩短。但是，氧化应激对于过表达TERT 的成纤维细胞的端粒酶则没有明显的作用。其原因与端粒酶的抵抗氧化应激作用有关。 端粒酶最近被发现有抵御氧化应激的作用。甚至有学者提出，保护细胞免收氧化应激的损伤才是端粒酶所起的主要作用，而非传统认为的维持端粒的长度。 研究发现，端粒酶的催化亚基hTERT可以保护人的成纤维细胞，使之免受氧化应激的破坏。过表达的TERT，可以有效抵抗端粒的缩短，防止复制衰老。事实上，除了维持端粒长度之外，端粒酶还有许多不依赖于端粒的其他作用。比如延长细胞寿命，增加细胞的各种应激抗性，抵抗特定的DNA损伤剂以及抵御细胞凋亡。 抗氧化剂对于端粒酶的作用，在正常细胞和癌细胞中，呈现出相反的结果。正常细胞中，抗氧化剂维持端粒酶的活性，防止端粒缩短，抑制细胞衰老。研究发现Asc2P 可以防止人血管内皮细胞端粒酶活性的减弱。在人肝细胞L-02培养基中加入抗氧化剂亚硒酸钠, 发现端粒酶活性和hTERT基因表达水平显著性增高, 且呈一定的剂量-效应关系。类似的，用抗氧化剂干预酿酒酵母细胞，检测到细胞端粒相对于对照组的延长，端粒酶活性增加。白首乌C21甾可以提高心脏组织中的端粒酶活性。 癌细胞中，抗氧化剂所表现出的却是抑制端粒酶的活性。它可以防止细胞端粒继续延长，促进癌细胞的衰亡。已由多个实验对此进行了证实。抗氧化剂对三氧化二砷可以诱导人白血病HL60细胞G2-M期细胞凋亡且对端粒酶有抑制作用。丁酸钠和阿霉素可以抑制宫颈癌Hela细胞增殖，联合应用具有协同效应。此效应与抑制端粒酶活性、下调hTERTmRNA表达有关。小剂量维生素C能增强As2 O 3 诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡，并能增强As2 O3 对细胞内端粒酶活性的抑制作用。 端粒酶在正常细胞与癌细胞中表现出的不同作用的具体原因尚不清楚。推测与细胞内的氧化还原微环境有关。
