基本信息
- 项目名称：
- PNRSV单克隆抗体及其ELISA检测试剂盒的制备
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 科技发明制作A类
- 简介：
- 我国对PNRSV的ELISA检测均依赖于国外的抗血清。价格昂贵，检测的成本非常高。该作品在制备了针对PNRSV的单克隆抗体的基础上，开发了检测田间植物中是否携带PNRSV的ELISA检测试剂盒。试剂盒开发的技术含量高，但试剂盒使用时的技术含量低，对仪器设备要求低，适于推广至乡镇级基层检验检疫部门的工作人员操作使用，应用前景广阔。
- 详细介绍：
- 应用杂交瘤技术制备了3株分泌针对李属坏死环斑病毒（PNRSV）单抗的细胞株，分别命名为1D11、2G7和4H2。三种抗体均只与PNRSV发生反应，不与近似种李属矮缩病毒、苹果茎痘病毒和苹果褪绿叶斑病毒等的抗原发生交叉反应，在检测了单抗效价和检测灵敏度的基础上，建立了1D11稀释10000倍，酶标二抗稀释5000倍，植物样品的检测浓度为50mg/mL的间接ELISA检测系统用于田间样品的检测，并进一步开发了试剂盒。该试剂盒的样品检测量大于400份。在此检测系统下，能准确检测待检植物样品是否携带有PNRSV。
作品专业信息
设计、发明的目的和基本思路、创新点、技术关键和主要技术指标
- 一、目的 制备基于单克隆抗体的能检测出李属坏死环斑病毒（PNRSV）的ELISA检测试剂盒，帮助各出入境检验检疫局、基层植物保护站、植物检疫站工作人员解决可以快速、准确地鉴定近几年新入侵我国的植物病毒PNRSV的难题。 二、基本思路 1. 应用杂交瘤技术，通过动物免疫、细胞融合、细胞克隆化培养及酶联免疫吸附试验（ELISA）检测，筛选出能分泌针对PNRSV的单克隆抗体的细胞株； 2. 应用ELISA检测单克隆抗体的特异性明确该抗体的应用前景； 3. 通过测定单克隆抗体的效价、检测灵敏度以及样品的稀释倍数对检测结果的影响，确定ELISA检测的最佳工艺条件，开发出基于单克隆抗体并适于PNRSV检测的ELISA试剂盒。 三、创新点 1．国内首次制备出针对PNRSV的单克隆抗体； 2．国内首次确定采用ELISA检测田间发病植株的最佳工艺条件，并开发出检测PNRSV的试剂盒。 四、技术关键 1．筛选出分泌针对PNRSV的单克隆抗体的杂交瘤细胞株； 2．制备PNRSV的ELISA检测试剂盒。 五、主要技术指标 利用该试剂盒能准确鉴定出植物样品中是否含有PNRSV。
科学性、先进性
- 基于单克隆抗体的ELISA解决了多抗血清容易产生交叉反应的问题，它将McAb与抗原的免疫反应以及酶的高效催化反应有机的结合在一起，具有检测灵敏度高、特异性强、仪器简单、自动化程度高、检测田间样本多等特点。很好的解决了植物病毒很难用传统的生物学方法和电镜检测法进行鉴定的难题。此外，该方法的核心技术是要制备出高度特异性的McAb。这一部分工作的技术含量高，要求有专业实验室、先进的仪器设备及经验丰富的专业科研人员才能完成。一旦制备出了McAb，后期的ELISA检测则具有操作简单、设备要求少、易于推广等特点。基层单位只要有恒温培养箱、普通冰箱和微量移液枪或微量进样器等设备就具备该方法的实验条件。而基层农技术人员则只需要按照ELISA检测步骤把试剂逐步加入到酶标板的反应条中并按时洗涤更换反应即可。试验的结果则根据反应的颜色变化来判定，十分直观。
获奖情况及鉴定结果
- 无
作品所处阶段
- 实验室阶段
技术转让方式
- 技术入股
作品可展示的形式
- 实物、产品
使用说明,技术特点和优势,适应范围,推广前景的技术性说明,市场分析,经济效益预测
- 利用基于单克隆抗体的ELISA检测试剂盒具有检测特异性高、成本低、时间短、检测量大、操作方便等优点，经济效益十分明显。 本试剂盒适于各出入境检验检疫局、植物保护站和植物检疫站的基层工作人员使用，原因如下：（1）只要按照试剂盒说明书即能完成检测；（2）基层工作单位具备恒温培养箱、普通冰箱和微量移液枪等简单的设备，（3）试剂盒提供全部试剂，能保证试剂盒的推广应用。 分子生物学方法的检测成本为近10元/样品，且检测成本不随样品数增加而降低。应用本试剂盒，前期细胞株的筛选成本约15000元，此后的检测成本低于0.6元/样品。由于细胞株筛选的成本是一定的，因此，检测的数量越大，每一个样品分摊的成本越低，只要检测样品总量达到3万个，则每检测一个样品的全部成本约为1元。如果全国所有县、市的植物保护站和植物检疫机构甚至是国外的相关机构都采用该试剂盒，其样品检测的数量可达几十万个/年，经济效益可观。
同类课题研究水平概述
- 1 国外的研究及发展 Valleau（1932）首次在李和桃树上发现PNRSV造成的危害。目前，该病的发生已遍及欧洲、亚洲、非洲、南美和北美洲及大洋洲的40多个国家和地区。普遍危害欧洲大樱桃、酸樱桃、桃、苹果、杏和洋李等李属和蔷薇属植物，此外还侵染烟草、西瓜、菜豆、豌豆、草木樨、莴苣、向日葵等草木寄主。2002年Verma等又报道了新的寄主秋海棠。 据国外研究，该病毒侵染危害能力较强，几乎可侵害所有的李属植物，引起坏死，皱缩、花叶、环斑等，特别在苗期中发生会造成严重损失。被侵染的作物损失一般在10%-15%，严重时可达70% 。 国外对PNRSV的研究报道较多，除早期的发生与诊断外，检测PNRSV的方法主要用酶联免疫吸附试验(ELISA)。采用分子生物学技术检测PNRSV并对病毒基因组序列进行测定也已成形，RT-PCR和IC-RT-PCR已应用于PNRSV的检测。 2 国内的研究及发展 PNRSV是我国重点控制的对外检疫性有害生物，中国学者近年来也开展了对PNRSV的研究。周媛月等在对陕西西安地区甜樱桃园的调查中，首次报道了PNRSV在中国境内的发生情况。山东、辽宁两省也相继检测发现了PNRSV。李明福等（2005年）对北京怀柔地区部分核果类果园进行疫情调查时，发现有PNRSV感染的情况，韩丽娟等（2007年）用分子生物学的方法首次鉴定了PNRSV对百合的侵染，证明了百合是PNRSV的一个新寄主。 PNRSV为核果类果树的主要病毒，侵染核果类各种果树，危害严重。这一病毒在我国甜樱桃上感染率很高，且多与ApMV混合感染，造成严重的树体衰弱和流胶。 PNRSV的检疫方法有：生物学方法、电镜检测法、分子生物学方法和免疫学方法。酶联免疫吸咐（ELISA）法是病毒检测的常用技术手段。ELISA检测技术具有灵敏度高、特异性强、安全、快速、一次可作大量样品等优点，非常适用果树病毒的普查和快速检测。目前我国对PNRSV的ELISA检测均依赖于购买国外的抗血清。检测效果好，但从国外进口抗血清价格非常昂贵，导致检测的成本非常高。因此，我国应加强对核果类病毒抗体制备方面的研究。 本实验通过制备针对PNRSV的单克隆抗体，确定ELISA检测的最佳工艺条件，并开发了检测试剂盒，帮助我国快速准确地鉴定进境花卉携带的PNRSV。
