基本信息
- 项目名称：
- 凝胶上安全便捷DNA检测技术的开发
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 本研究所提出的甲基紫染色法检测DNA技术不需要固定，只需染色和水洗两个步骤，可在20分钟内完成，并且具有灵敏度高、重现性好、染色背景好、使用安全、成本低等诸多优点，预实验表明该方法有望代替高致畸致癌性的EB染色法，将在多方面超过国际上公认的染料检测技术，从而填补了国内空白并具有国际先进性。
- 详细介绍：
- 在生命科学研究领域中，作为生物体内的重要大分子，核酸是研究生命现象与本质的物质基础，特别是随着基因组学、功能基因组学和结构基因组学的快速发展，它的应用范围越来越广，主要包括：对特定基因功能的识别、新药筛选、疾病诊断、药物作用机理、生物各个时期的发育变化等方面的研究，它几乎渗透到生命科学的各个领域。因此，对核酸的研究具有重要的意义。同时，目前凝胶分离是研究DNA的最常用手段使得凝胶上DNA的检测技术对DNA的相关研究起着至关重要的作用。本研究开发的DNA染料检测技术有很多指标国际领先。该技术生产工艺相对简单，成本相对低廉，产品的安全性较好，可以在较小的资金投入下实现产品化，因此风险较低。产品使用成本可控制在5-10元人民币/张凝胶不等，给整个生物大分子检测行业带来巨大的经济效益，同时产生较好的社会效益。
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撰写目的和基本思路
- 本研究最终目标是开发安全、便捷、灵敏的DNA检测试剂盒，从而满足科研工作者对灵敏、便捷、安全、高通量检测技术的迫切需求。 通过查阅大量文献，因此设想用甲基紫代替EB检测DNA。自从我们5人参与这一研究后，通过大量实验，不断攻克如何改善甲基紫检测DNA技术这一难题，做了甲基紫染料和不同产品的对比(如安全性、灵敏度、重现性、操作步骤等等)，同时总结经验，优化实验条件，取得成效。
科学性、先进性及独特之处
- 1.灵敏度高：最低检测量达到2-4 ng/band；2.操作简捷：不需要固定，只需染色和水洗两个步骤，可在20分钟内完成；3.重现性好：受温度、摇床摆动频率等外部条件影响小；4.染色背景好；5.使用安全：采用毒性低的试剂，提高实验操作的安全性，对环境污染小；6.成本低：预实验表明该方法有望代替高致畸致癌性的EB染色法，将在多方面超过国际上公认的染料检测技术，从而填补了国内空白并具有国际先进性。
应用价值和现实意义
- 由于基因学的飞速发展，DNA检测市场将逐年扩大，前景很是乐观。经初步研究表明：本研究开发的DNA检测技术有很多指标国际领先，较适合高通量的基因组分析研究，这将打破国外大公司在DNA染色领域对高新技术试剂和试剂盒的垄断地位，是解决全国生物医药在DNA染色领域问题的关键。该技术生产工艺相对简单，成本相对低廉，产品的安全性较好，这给整个生物大分子检测行业带来巨大的经济效益，同时产生较好的社会效益。
学术论文摘要
- 在本研究中，我们开发了一种新型的以聚丙烯酰胺凝胶[7]为载体的DNA染料染色法，即甲基紫(MV)染色法。经过电泳，凝胶在100毫升的染色液中染色需要20分钟。之后，凝胶在100毫升的50%乙醇中洗涤1分钟接着泡在100毫升的去离子化水中脱色1分钟。一般将甲基紫溶解到90%的乙醇中制成0.4%的母液，储存在严格密封的铝箔瓶中室温保存数月。在使用前，用去离子水稀释该母液制成0.0008%的甲基紫染色液。 我们最新开发的MV染色法的灵敏度已接近目前最常用的EB染色法，但它安全、便捷、环保的特点将有望取代EB染色法。并且，我们所开发的甲基紫染色液在部分实验室的试用情况也证明，它满足了科研工作者对DNA检测技术的要求，是一种具有良好应用前景的DNA染色方法。
获奖情况
- 1、论文《凝胶上安全便捷DNA检测技术的开发》 已投稿至中国药科大学的《药物生物技术》 2、专利申请《甲基紫在DNA检测中的应用》 受理号：201110096266.7 3、所获奖励：温州医学院第十二届“挑战杯” 大学生课外学术科技作品竞赛二等奖
鉴定结果
- 预实验中，对本染色法、EB染色法、NB染色法的灵敏度的比较，表明本染色法可检测2-4 ng/band DNA，其灵敏度已经接近EB染色法（该法目前常用），实验得浓度0.0008%（PH6-8）为最佳。
参考文献
- [1]N.C. Stellwagen, Electrophoresis of DNA in agarose gels, polyacrylamide gels and in free solution, Electrophoresis 30 (2009) S188–S195. [2] Long, X. F., L, D. S.,W, N., Z, C. H. et al., Spectrochimica Acta Part A 2008, 69,142-147. [3] B.J. Bassam, P.M. Gresshoff, Silver staining DNA in polyacrylamide gels, Nat. Protoc. 2 (2007) 2649–2654. [4]Lee-Jun C. Wong. GJB2 mutation spectrum in Inner Mongolia and its comparison with other Asian populations[J]Journal of Otology, 2007, (02) . [5] Y.I. Yang, H.Y. Hong, I.S. Lee, D.G. Bai, G.S. Yoo, J.K. Choi, Detection of DNA using a visible dye, Nile blue, in electrophoresed gels, Anal. Biochem. 280 (2000) 322–324. [6]Seville M. A whole new way of looking at things: the use of Dark Reader technology to detect fluorophores, 2001,22(5): 814-828. [7]Jin LT, Choi JK. Usefulness of visible dyes for the staining of protein or DNA in electrophoresis. Electrophoresis, 2004, 25(15): 2429-2438.
同类课题研究水平概述
- DNA结构与功能的研究及其定性、定量检测一直是分析化学和生命科学研究的前沿领域，凝胶上染色作为检测DNA的常用手段，能够快速的对DNA进行分析。所以，寻找一种凝胶上安全便捷的染色技术成为DNA检测研究领域的热点之一。 目前用于凝胶上DNA研究和测定的方法有荧光染色法、有机染料染色法、银染法、负染法，而国内外90%以上的实验室都采用了荧光染色法中的EB法。报道过用于DNA检测的荧光染料的文献，主要包括Hoechst 33258、Pico Green、YOYO、TOTO等。银染法是迄今为止灵敏度最高的一种染色方法，其染色结果在可见光下即可直接检识。有机染料染色法的染色结果同样可以在可见光下直接检识，而且具有操作简便、重现性好、成本低廉等优点。 我国电泳染色试剂约有2亿元的市场，随着生命科学的飞速发展，潜力巨大。但是，我国的电泳染色试剂基本有以下缺点：质量常不过关、批次常不稳定、大量依赖进口。而国内染色试剂产业现状-存在问题有以下几点：1、品种——国内尚无荧光、负染试剂盒；2、技术——染色技术研发方面投入不足；3、质控——原料多依赖进口，其稳定性影响试剂质量；4、评价机制——试剂生产厂家替代评价环节薄弱。在1960年至1980年间，国内外染色试剂主要以染料染色法为主。到了2000之后，就以荧光染色法为主。1970年至1980年间，国外申请专利只有32项，之后的每十年分别为227项、361项和612项。而在1960年至1970年间，国外发表SCI论文42项，之后每十年分别为136项、217项、356项和377项。相对而言，国内申请专利有16项，其中本科研小组所在的团队的占了7项。国内发表SCI论文35篇，而本团队就有23篇。长时间的市场调研，显示国外主要试剂提供公司有BIO—RAD、SIGMA和Agilent等，国内则主要有碧云天、科瑞生物和本团队的安得森公司。本团队不管在国内还是国外该领域中都具有很好的优势。 本研究开发具有独立知识产权且具有快速、灵敏、适合基因组学研究的DNA检测技术，填补了国内空白并具有国际先进性。该研究成果将打破国外大公司在DNA染色领域对高新技术试剂和试剂盒的垄断地位，成为解决全国生物医药在DNA染色领域的问题的关键。
