基本信息
- 项目名称：
- MAP30基因毕赤酵母高效表达菌株的构建及其表达产物的抗肿瘤活性研究
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 从苦瓜中克隆MAP30全长基因，并将该基因连接至表达载体pPIC9k中，转化GS115菌株，建立菌落PCR快速筛选方法，得到高效表达的重组毕赤酵母菌株，为重组MAP30蛋白药物的开发奠定基础。
- 详细介绍：
- 根据GeneBank公布的MAP30基因序列，设计了特异引物，并采用改良SDS法从苦瓜表皮中提取的基因组DNA，运用PCR技术扩增出全长861bp的MAP30基因。该基因经酶切、连接，最后克隆至pPIC9K载体上。重组pPIC9k-MAP30质粒经Sac I酶切线性化后，采用电转法转入GS115毕赤酵母细胞中，再经G418筛选、菌落PCR鉴定，最终得到高拷贝重组毕赤酵母GS115菌株。重组菌株经甲醇诱导表达产生目的MAP30蛋白，以SDS-PAGE和N-端测序等对所表达蛋白进行分析鉴定，MTT法测定体外抗肿瘤活性。结果 基因测序表明，该基因已成功插入酵母表达载体pPIC9a-factor分泌信号下游，同源性分析表明该基因与GenBank（AF284811）的核苷酸同源性达99.9%，氨基酸同源性达100%。菌落PCR显示外源基因已整合入酵母GS115菌株中。重组菌株在甲酵诱导下，经SDS-PAGE分析可见表达的32kD特异性条带，与预期相吻合，经Lowry法分析表明目的蛋白表达量达 910 mg/L。初步的抗肿瘤实验显示，重组MAP30具有明显的抑制胃癌细胞SGC7901的活性，IC50为 30ug/mL。N-端测序进一步表明MAP30全长蛋白在毕赤酵母中获得了正确表达。结论 成功地克隆了MAP30全长基因，构建了含MAP30基因的重组毕赤酵母表达载体，并获得了高效表达的重组毕赤酵母菌株，目的蛋白得到了正确的表达，且生物活性较高，为下一步研究开发奠定了良好的基础。
作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 目的：从苦瓜中克隆MAP30全长基因，运用毕赤酵母系统高效表达，并进行初步抗肿瘤活性研究。 基本思路：根据GenBank公布的序列，设计引物，通过PCR扩增MAP30基因。该基因连接至pPIC9K上。用电转法转入GS115细胞中，G418等筛选鉴定出高拷贝重组GS115菌株。经甲醇诱导表达，以SDS-PAGE等对蛋白进行鉴定，采用MTT法测定该蛋白对胃癌细胞SCG7901株的抑制作用。
科学性、先进性及独特之处
- 从苦瓜中直接提取MAP30蛋白成本高、工艺复杂。但文献中大多利用大肠杆菌表达，表达产物易形成包涵体，产物活性低、分离工艺复杂。运用毕赤酵母表达MAP30蛋白尚未见报道。巴斯德毕赤酵母既具有分泌表达、表达量高、具有蛋白质的加工、翻译后修饰等功能。本研究建立了快速、简便的菌落PCR筛选方法，构建出重组毕赤酵母高效表达菌株，诱导表达产物经检测产量和活性也比较令人满意，为进一步抗肿瘤研究打下基础。
应用价值和现实意义
- 本研究运用毕赤酵母表达系统，实现了较高活性MAP30蛋白的表达，表达量为910mg/L。体外抗肿瘤实验表明，重组MAP30蛋白对人胃癌细胞SGC7901具有明显抑制作用，且呈剂量依赖性。MAP30可以特异地抑制受病毒感染的细胞和肿瘤转化细胞，诱发其凋亡，但对正常细胞如T细胞、二倍体细胞和精细胞等却没有毒副作用，显示了巨大的临床应用价值。本研究为将MAP30蛋白开发成特异性抗肿瘤药物奠定基础。
学术论文摘要
- 目的从苦瓜中克隆MAP30全长基因，并将该基因连接至表达载体pPIC9k中，转化GS115菌株，建立菌落PCR快速筛选方法，得到高效表达的重组毕赤酵母菌株，为重组MAP30蛋白药物的开发奠定基础。方法根据GeneBank公布的MAP30基因序列，设计引物，并以采用改良SDS法提取的基因组DNA，通过PCR技术，扩增出全长861bp的MAP30基因。该基因连接至pPIC9K载体上。采用电转法转入GS115毕赤酵母细胞中，再经MD、G418筛选以及菌落PCR鉴定，最终得到高拷贝重组毕赤酵母GS115菌株（GS115/pPIC9K-MAP30）。重组菌株经甲醇诱导表达，以SDS-PAGE、lowry法、N-端测序、MTT法等对所表达蛋白进行鉴定与活性分析。结果该基因已成功插入酵母表达载体中。菌落PCR显示外源基因已整合入酵母GS115菌株中。经SDS-PAGE分析可见表达的32kD特异性条带，与预期相吻合，经测定蛋白表达量达910mg/L。初步的抗肿瘤实验显示，重组MAP30具有明显的抑制胃癌细胞SGC7901的活性，IC50为30g/mL。
获奖情况
- 作品于2010年4月在全国中文核心期刊《生物技术》杂志第20卷第2期发表
鉴定结果
- 真实，有一定的学术价值
参考文献
- 2、鞠金秀，陈瑞莞，宋志宏. 苦瓜蛋白MAP30 研究进展[J]. 热带医学杂志，2009 ，9（11）：1340-1342 3、林育泉，刘思，周鹏. 新型抗病毒抗肿瘤苦瓜蛋白MAP30的研究进展[J].华南热带农业大学学报，2005,11（4）：24-29 4、林育泉，周鹏，曾召绵. 苦瓜MAP30蛋白基因克隆、表达及其抗肿瘤活性研究[ J ]. 中国生物工程杂志，2005，25（5）：60-66. 5、孟延发, 孟雪琴, 张雪梅, 等. 苦瓜籽核糖体失活蛋白的基本性质研究[ J ]. 兰州大学学报(自然科学版)，2000，36(4): 80 6、Schreiber CA , Wan L , Sun Y , et al . The antiviral agents ，MAP30 and GAP31，are not toxic to human spermatozoa and maybe useful in preventing the sexual transmission of human immunodeficiency virus type 1[ J ] . Fertil Steril ，1999，72(4) ：686 - 690. 7、Bourinbaiar A S，Lee-Huang S. Potentiation of anti-HIV activity of anti-inflammatory drugs，dexamethasone and indomethacin, by MAP30, the antiviral agent from bitter melon. Biochem Biophys Res Commun，1995，208(2): 779
同类课题研究水平概述
- MAP30（momordica anti-HIV protein of 30 kD） 是从苦瓜（momordica charantia L）果实和种子中分离得到的单链核糖体失活蛋白。MAP30 基因没有内含子，全长 861 bp，编码 286 个氨基酸，理论相对分子质量为 32 000。其 51～53 位的 Asn-Leu-Thr 是 N 连接糖基化位点。MAP30 具有抗病毒、抗肿瘤和抗微生物等多种生物学活性 , 尤其对 HIV 有显著的抑制作用，重组蛋白也具有与天然蛋白相同的功能和活性，MAP30 可以特异地抑制受病毒感染的细胞和肿瘤转化细胞，诱导凋亡，但对正常细胞没有毒副作用，因此具有巨大的临床应用价值。 Rybak 等于 1994 年通过抗癌药物筛选计划首次发现MAP30 具有抗肿瘤细胞株的活性。Lee-Huang 等在体外用MAP30 处理 MDA-MB-231 人乳腺肿瘤细胞, 发现细胞的分化和 HER2 的分泌都受到抑制。将 MDA-MB-231 人乳腺肿瘤细胞植入 SCID 小鼠,在小鼠身上发展。成为广泛转移性肿瘤,所有小鼠在46 d内死亡。给带有人乳腺肿瘤细胞的 SCID 小鼠,每天一次10mg MAP30注射治疗,连续10 d,能够显著提高小鼠的存活率,其中大约20%～25%的小鼠能够在96 d内带瘤生存。其结果表明, MAP30 在体内和体外都具有抗乳腺肿瘤细胞的活性。其他研究也证明, MAP30对多种病毒和肿瘤细胞有效,而对未感染的人正常细胞如T 细胞、巨噬细胞、单倍体细胞等均无毒性[5～9]。 从植物中直接提取MAP30蛋白成本高、工艺复杂，因此采用基因工程手段生产重组MAP30蛋白是一条有效途径。在已报道的文献是大多利用大肠杆菌表达，如庄东红、林育泉等利用大肠杆菌成功地进行了MAP30蛋白的表达，表达产物具有一定的抑瘤活性。大肠杆菌表达系统虽然操作方便，但是表达产物易形成无活性的包涵体，不利于分离纯化。巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是利用甲醇作为唯一碳源，既具有原核表达系统良好的可操作性，又有真核表达系统的许多优点，如蛋白质的加工、翻译后修饰等，该系统可进行胞外分泌表达，表达量高，是外源基因理想的表达系统。
