基本信息
- 项目名称：
- 重金属铜检测生物传感器的构建及其初步应用
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 能源化工
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 重金属铜的检测是评价环境污染的重要指标之一，本项目通过基因敲除技术和基因融合技术成功构建一株能特异、敏感检测铜离子的微生物传感器，为监测影响到人类健康﹑食品安全的重金属铜离子提供了一种简便、高效、高性价比的实施方案。
- 详细介绍：
- 研究背景： 铜是机体必须的微量元素，但是过量的重金属铜对于所有的生命体都是有毒的。人体内过量的铜参与了很多疾病的发生和发展，比如印度儿童肝硬化， Tyrolean婴儿慢性间质性肝炎、Wilson病等。随着工农业的发展，很多含有铜离子的污染物排放入江河湖泊中，污染了土壤、水源甚至是日常食用的粮食蔬菜，给人类的生活和健康造成了严重的危害，因此，对环境中铜离子的检测是环境评估中必不可少的。目前常用的铜离子检测方法有化学分析法、极谱法、电感耦合法和原子吸收法，这些方法均因操作繁琐、需要专用的仪器及实验室配备等存在一定局限性，而生物检测技术则很好地克服了以上不足。 现有的关于铜离子生物检测技术的研究主要基于大肠埃希菌体内具有针对铜离子的精细调控系统： CopA是一类P-型ATPase，作用是将细胞质内的铜离子向核周质泵出；CueO是一类氧化酶，作用是在核周质内将Cu+氧化为Cu2+，防止核周质内铜离子进入细胞质，cus系统负责将核周质内的Cu2+向细胞外环境泵出，这些作用受到CueR调节子的调节。国内外研究人员尝试利用CopA启动子融合报告基因，以野生型大肠埃希菌作为宿主菌构建生物传感器来检测铜离子，其特异性不错，但是敏感性不高，更为重要的是细菌长期处于高铜环境会由于自身的保护机制而产生铜离子耐受现象，造成检测结果的不稳定，不能用于污染物的检测。本研究利用基因敲除技术对宿主菌进行改造，构建了能够检测铜离子的特异、敏感型微生物传感器，有望应用于环境中铜离子的检测。 研究内容： 基于生物检测法检测铜敏感性不高是由于铜离子不能顺畅进入大肠埃希菌导致的假设，我们对大肠埃希菌进行改造，并从以下四个方面进行研究： 1）敲除大肠埃希菌体内负责将铜离子从细胞内向细胞外泵出的基因以及影响铜离子进入细胞内的基因； 2）利用光量更强的GFPmut2作为报告基因构建融合报告载体检测铜离子； 3）对构建好的生物传感器进行检测条件的优化以及相关参数的测定； 4）推广应用于水源、土壤、蔬菜和食品等铜离子的测定。 研究结果: 通过基因敲除技术敲除大肠埃希菌体内负责将铜离子从细胞内向细胞外泵出的基因copA和cusA以及影响铜离子进入细胞内的基因cueO，实验结果显示△copA-△cueO-△cusA突变菌对铜离子非常敏感，在M9基础培养基中生长其敏感性是野生型大肠杆菌MC4100的64倍。以其为宿主菌，同时以光亮更强的GFPmut2作为报告标志基因构建融合报告载体，构建得到的传感器对铜离子敏感性最高，线性范围最好，其敏感性为野生型的35倍左右，不仅极易摄取外环境中的铜离子，使外环境中铜离子的痕量变化被突变菌株所监测到，且保持对铜离子高敏感状态的稳定性和持久性。 该传感器线性检测范围为5.0×10-5-2.5×10-3 mM（0.0032-0.16 mg/L），国家规定Cu2+检测的标准方法——原子吸收光谱法测定水样的检测范围是0.05-5 mg/L，相比之下该生物传感器最低检出限更低，敏感性更高，更适于痕量Cu2+的检测。 研究成果： 1）专利保存菌种一株，保存号为CGMCC No.4624，命名E. coli WMC-006 2）以学生为第一申请人申请专利，已获得专利受理书。 3）已获得学校推荐，参与2011年浙江省大学生科技创新活动计划（新苗人才计划）的申报。 4）荣获浙江省第二届大学生生命科学竞赛一等奖。 创新之处： 1）本研究通过基因敲除技术敲除大肠埃希菌体内维持Cu2+稳态的3个基因，构建对Cu2+高度敏感的三基因突变菌作为宿主菌，解决了普通微生物作为生物传感器宿主菌检测敏感性不高的问题。 2）该生物传感器以增强型绿色荧光蛋白作为报告基因，产生的荧光强弱可以通过肉眼观察判断，无需紫外激发，为野外实时监测带来方便。 3）本方法为监测影响到人类健康、食品安全的重金属铜提供了一种简便、高效、高性价比的解决方案。
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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 目的：构建特异、敏感的铜离子检测生物传感器。 基本思路：选用绿色荧光蛋白GFPmut2为报告标志物，利用E. coli copA启动子来构建融合报告载体；采用Red重组系统敲除野生型E. coli MC4100菌体内负责维持铜离子稳态的三个基因，构建对铜离子高度敏感的突变菌株作为宿主菌；然后进行条件的优化及特异性、敏感性、最适检测范围等相关参数的测定；最后利用该传感器检测水样中的铜离子。
科学性、先进性及独特之处
- 本作品选用增强型绿色荧光蛋白作为报告标志物，利用E. coli copA启动子来构建融合报告载体，同时利用基因敲除技术对宿主菌进行改造，解决了普通微生物作为宿主菌检测铜离子敏感性不高的问题，更是避免了野生型大肠杆菌的铜离子耐受现象而造成检测结果的不稳定，构建了能够检测铜离子的特异、敏感型微生物传感器，为检测铜离子提供了一种简便、高效、高性价比的解决方案。
应用价值和现实意义
- 本研究利用GFPmut2作为报告标志物，不但具有通用性强、易于实现融合表达、荧光稳定、检测方便、无毒害等优点，而且具有比普通绿色荧光蛋白更强的荧光信号，日光中的蓝光就可以激发出亮绿色的荧光，为野外实时监测带来很大方便。同时以细菌作为宿主菌，检测快速﹑成本低且易于维护，并且该生物传感器对于铜离子的检测具有很高的敏感度及特异性，有望应用于铜离子检测的初筛。
学术论文摘要
- 重金属铜的检测是评价环境污染的重要指标之一。为构建能特异、敏感检测环境中铜离子的生物传感器，我们选用绿色荧光蛋白GFPmut2作为报告标志物，利用E. coli copA基因启动子来构建融合报告载体PcopA::gfpmut2-pET28a；采用Red重组系统敲除野生型E. coli MC4100菌体内负责维持铜离子稳定状态的copA﹑cueO和cusA三个基因，构建对铜离子高度敏感的ΔcusA-ΔcopA-ΔcueO三基因突变菌株作为宿主菌；然后对此生物传感器进行测定条件的优化及特异性、敏感性、最适检测范围等相关参数的测定；最后利用该传感器检测水样中的铜离子。研究结果表明，此生物传感器对铜离子具有敏感性高、特异性强和检出限低等优点，对铜离子的敏感性为野生型菌株的35倍左右，且仅被铜离子诱导，而对其它金属离子不敏感，最适检测铜离子浓度范围为5.0×10-5-2.5×10-3 mM。该项研究成功地构建了特异、敏感检测铜离子的生物传感器，并将其初步应用于水样中铜离子的检测，为监测影响到人类健康﹑食品安全的重金属铜离子提供了一种简便、高效、高性价比的实施方案。
获奖情况
- 1. 本作品的前期研究内容荣获浙江省第二届大学生生命科学竞赛一等奖。 2. 该作品获得的能够检测重金属铜的敏感菌株已经保存到中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，编号为CGMCC No.4624，命名E. coli WMC-006；为了保护知识产权，论文虽已完成，但尚未在任何会议、杂志、报刊上公开发表。 3. 该作品的后续研究已获得学校推荐，参与2011年浙江省大学生科技创新活动计划（新苗人才计划）的申报中
鉴定结果
- 该作品通过基因敲除等技术成功构建对重金属铜高度敏感、特异的生物检测传感器，可以应用于铜离子检测的初筛，同时专利申请已被受理，并获浙江省第二届大学生生命科学竞赛一等奖，得到了评审专家的肯定和认可。
参考文献
- 技术： PCR扩增技术、交叉PCR技术、基因敲除技术、基因克隆技术、电转化技术、SDS-PAGE等。 技术文献： 1. Muller T, Feichtinger H, Berger H, et al. Endemic Tyrolean infantile cirrhosis: an ecogenetic disorder. Lancet, 1996, 347(9005):877-880 2. Munson GP, Lam DL, Outten FW, et al. Identification of a copper-responsive two-component system on the chromosome of Escherichia coli K-12. J Bacteriol, 2000, 182(20):5864-5871 4. Ivask A, Rolova T, Kahru A. A suite of recombinant luminescent bacterial strains for the quantification of bioavailable heavy metals and toxicity testing. BMC Biotechnol, 2009, 9:41 5. Datsenko KA, Wanner BL. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A, 2000, 97(12):6640-6645 6. Abbruzzetti S, Grandi E, Viappiani C, et al. Kinetics of acid-induced spectral changes in the GFPmut2 chromophore. J Am Chem Soc, 2005, 127(2):626-635
同类课题研究水平概述
- 在过去几年中，铜离子含量测定在环境分析中扮演着重要的角色。分析检测方法也几度易帜，从原有的极谱法到原子吸收分光光度法、光度法，到电感耦合法，但这些方法往往受到实验条件的限制，不仅需要大型仪器，同时还存在操作繁琐等弊端。而生物检测技术则克服了如上不足，生物检测技术的基本原理即是利用模式生物对特定化学物质的分子反应机理，需要三种必需的元件：针对特定或具有相似性质的化学物质的感应器；由感应器控制的启动子；受此启动子控制的报告基因。在设计生物检测技术时，由于细菌具有在环境中大量存在﹑生长快速﹑低成本及易维护等优点而受到研究人员普遍亲睐。在过去的研究中利用生物检测法来检测环境中的特定污染物已经引起了极大的关注，至今已经研发了一系列针对特定有机物和无机化合物的生物传感器，如：重金属、甲苯及其衍生物以及其它物质。 现在对铜离子测定的生物检测技术也有所研发，其中比较清楚大肠杆菌针对铜离子的反应机理，大肠杆菌具有精细的调控系统使得细胞内铜离子保持在较低的水平，CopA是一类P-型ATPase，作用是将细胞质内的铜离子向核周质泵出；CueO是一类氧化酶，作用是在核周质内将Cu+氧化为Cu2+，防止核周质内铜离子进入细胞质（铜离子只有一价形式可以穿过细胞膜）；当大肠杆菌处在低浓度的铜离子环境中，CopA和CueO会被大量的诱导表达，其受到CueR调节子的调节。高浓度的铜离子会激活Cus系统，使得铜离子从核周质向外环境泵出。这个机理提供了一个很好的检测模式，研究人员尝试利用copAp::lux和CueRCopA::LuxCDABE融合报告基因以野生型E. coli作为宿主菌来检测铜离子，这些特异性不错，但是敏感性不是很高，更重要的是野生型大肠杆菌长期处于高铜的环境由于自身的保护机制而造成铜离子耐受，其作为检测铜的宿主菌会造成不稳定，这些非常不利于污染物的检测，必须采用新的方法提高生物学检测方法检测铜离子的敏感度。 本项目敲除copA、cueO和cusA基因，构建了一株对铜离子高度敏感的大肠杆菌突变菌株，以其作为宿主菌来检测铜离子，其灵敏度提高到野生型的35倍。且利用GFPmut2蛋白作为报告物，它比野生型GFP蛋白更亮，而且蓝光就可以激发出亮绿色的荧光，不需要紫外设备爱就能观测到荧光，因为日光里就含有蓝光，这也为野外检测带来方便。
