基本信息
- 项目名称：
- 一种用于在水体病毒污染监控中检测病毒富集效果的重组噬菌体的构建
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 科技发明制作B类
- 简介：
- 本研究选择phiX174噬菌体作为代表，通过在野生型基因组中插入一段特异标签序列成功构建了一种指示病毒，通过测量富集前后该病毒的含量来评估富集体系效率。相比过去的评估方法，我们发明的方法在准确性以及实用性等方面有许多优势，为评估病毒富集体系提供了一种新的选择，为此我们已经设计出相应的试剂盒并着手联系污水处理厂等进行实地试验。此外，本研究提出了一种相对简便人工构建phiX174噬菌体的新技术。
- 详细介绍：
- 1、作品思路： 病毒是一种寄生致病的微小病原体，不能独立生存和繁殖，所以饮用水中的病毒数量往往很低，检测病毒首先要进行病毒富集。确定富集体系的效率是准确计算原水中病毒含量的前提。而评估病毒富集效果并不容易，尽管现在很多富集方法都在尽量减少核酸的损失，但是缺少一种精确的评估体系来判断一种富集方法造成的核酸损失率的大小。过去检测病毒富集体系效率一般是用吸光光度法。具体来说，将加入和富集的样品用生物分光光度法定OD值，参照萨姆布鲁克等(2002)公式，计算OD260／OD280值与RNA浓度(以肠道病毒为例，RNA浓度=OD260×稀释倍数×400lag／m1)。但是，这种方法有人为因素和仪器误差的缺陷；第二，具有该吸收波长的物质不仅仅是实验对象，还包括其他物质；第三，该方法没有特异性，不能将待测对象与环境中存在的病毒区分开来。而本研究构建的重组噬菌体，能够与环境中本身存在的噬菌体很好的区分开来，避免了以上误差。同样，如果采用野生型噬菌体或人类病毒等作为指示，常易与环境中已有的病毒混淆，同时存在安全隐患。本课题研制的重组噬菌体可以成为水体病毒富集检测的指示噬菌体和标准品，用于水质日常监测的实践。 水体中常见的污染病毒种类很多，最主要的病原有肠道病毒、腺病毒、杯状病毒等，这些基本都是二十面体结构的病毒，直径在50～100nm。为此我们选择了与这些病毒物理构造相对较为近似的噬菌体phiX174。phiX174是否完全适用，尚需要更多的数据进一步证明，但是从现有的噬菌体角度来看，phiX174是最合适的选择，我们以后将会考虑选择其他的病毒。phiX174噬菌体是自然界最小的病毒之一，能够比较准确地反映富集体系的效率。其核酸部分为单链环状DNA，含5386个核苷酸，编码8个基因（图1）。它也是第一个被测序的DNA基因组。我们将在野生型的phiX174基因组中插入一段较短的DNA序列，那样我们就可以通过PCR或免疫印记等方便的方法将它们从水中其他病毒中区别出来，计算富集后的回收率从而评估富集效率。在本研究中，通过基因操作在噬菌体phiX174的基因组上添加一段特征序列，获得指示噬菌体。我们采用的特征序列是实验室常用的Flag和His标签，片段较短对噬菌体而言负担较小且检测相对准确方便。富集前定量加入该指示噬菌体，通过过滤、絮凝、吸附等方法进行水体病毒富集后，用特征引物结合Real-time PCR检测该指示噬菌体的回收率，就可以评判富集体系的效率。若一种富集体系的回收率达到70%以上，则认为该富集方法很有效。除了用于富集效率的评估，也可以用于评估饮用水制备过程中对病毒的清除效果。例如，可以在原水中定量加入该噬菌体，通过紫外、臭氧、加氯、过滤等方法进行病毒的清除，然后用Real-time PCR检测残留的病毒量，进行病毒清除效果的检测。这些方法简单高效，成本也非常低廉（只需构建一份母本，其余在需要时可通过感染宿主菌进行扩增），有很大的应用价值和现实意义。 所以，使用这种人工噬菌体，我们就可以更准确地检测富集系统或者消毒系统的效率，从而得到更加准确的数据反映水中病毒的含量。另外，我们提出的新颖且简便的人工构建噬菌体技术还可以被用于其他领域。 2、作品创新点 目前，在病毒富集体系的研究中，尚缺少一种评估体系对各种富集方法进行评估，本研究通过构建一种带有标记的指示噬菌体，来评判一种富集体系在富集过程中造成的核酸损失率的大小。在本研究中，我们通过基因操作在噬菌体phiX174的基因组上添加一段特征序列，获得指示噬菌体。在富集前定量加入该指示噬菌体，通过过滤、絮凝、吸附等方法进行水体病毒富集后，用特征引物结合Real-time PCR检测该指示噬菌体的回收率，就可以评判富集体系的效率。若一种富集体系的回收率达到70%以上，则认为该富集方法很有效，以此来建立评估体系。相比过去的评估方法（如测量比较富集前后的OD值等），我们的方法在准确性以及实用性等方面有许多优势，为评估病毒富集体系提供了一种新的选择。 本研究提出了一种相对简便人工构建噬菌体的新技术。由于以往研究受到病毒本身的限制：第一，由于病毒的基因组较小，且受到病毒衣壳的限制，不能插入很大的基因如绿色荧光蛋白基因这样的表达后易于观察的基因；第二，病毒的基因组不同于质粒，由于存在着大量的重叠序列，在插入基因的同时要保证不影响病毒结构蛋白的转录，还要保证插入周围有酶切位点。我们的方法在构建噬菌体的方法上是一个创新，今后还可以用于其它目的的噬菌体构建。 3、项目可行性论述 本研究中，我们选择的噬菌体是与水中常见的污染病毒如肠道病毒的构造相对较为近似的噬菌体phiX174。phiX174是二十面体结构的病毒，直径在50～100nm。phiX174是否完全适用，尚需要更多的数据进一步证明，但是从现有的噬菌体角度来看，phiX174是最合适的选择，我们以后将会考虑选择其他的病毒。phiX174噬菌体是自然界最小的病毒之一，其核酸部分为单链环状DNA，含5386个核苷酸，编码8个基因（图1）。它也是第一个被测序的DNA基因组。我们将在野生型的phiX174基因组中插入一段较短的DNA序列，那样我们就可以通过PCR或免疫印记等方便的方法将它们从水中其他病毒中区别出来。 本研究中我们选用的标签片段是实验室常用的Flag和His标签，插入到phiX174的编码病毒刺突蛋白的H基因中。通过实验验证，带有Flag标签的噬菌体构建成功，其表达的Flag标签片段可位于蛋白质的C端或N端。Flag标签系统已广泛应用于各种细胞类型，包括细菌、酵母和哺乳动物细胞等，相应的Flag标签抗体也被广泛应用。Flag抗体可以用于检测和Flag标签融合表达蛋白的表达、细胞内定位，以及纯化、定性或定量检测Flag融合表达蛋白等。同时，实验室里含有重组得到带有Flag噬菌体的所有水体将经过处理再排放，故不会在自然界中产生带有这些特定标签的噬菌体。 通过检测，我们已经成功构建了带有Flag标签的人工噬菌体。同时，我们已将其用于富集系统的效率检测。实验结果表明用这种人工噬菌体检测富集系统的富集效率是可行的，同时也说明这种人工构建噬菌体的技术也是可行的。
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作品专业信息
设计、发明的目的和基本思路、创新点、技术关键和主要技术指标
- 尽管现在很多富集方法都在尽量减少核酸的损失，但是缺少一种定量的评估体系来判断一种富集方法造成的核酸损失率的大小。以往使用方法测定时有背景干扰且常易与环境中已有的病毒混淆，同时存在安全隐患。本课题研制的重组噬菌体可以成为水体病毒富集检测的内部指示噬菌体和标准品，用于水质日常监测的实践。 水源中的主要致病病毒主要是肠道病毒，phiX174噬菌体与肠道病毒相似并且它是自然界中最小的噬菌体，也是第一个被测定全基因组的生物。在本研究中，我们通过基因操作在噬菌体phiX174的基因组上添加一段特征序列，获得指示噬菌体。在富集前定量加入该指示噬菌体，通过过滤、絮凝、吸附等方法进行水体病毒富集后，用特征引物结合Real-time PCR检测该指示噬菌体的回收率，就可以评判富集体系的效率。若一种富集体系的回收率达到70%以上，则认为该富集方法很有效。除了用于富集效率的评估，也可以用于评估饮用水制备过程中对病毒的清除效果。例如，可以在原水中定量加入该噬菌体，通过紫外、臭氧、加氯、过滤等方法进行病毒的清除，然后用Real-time PCR检测残留的病毒量，进行病毒清除效果的检测。这些方法简单高效，有很大的应用价值和现实意义，可以更准确地检测富集或者消毒系统的富集或消毒效率，从而使检测水中的病毒含量的数字更加真实。另外，这种人工构建噬菌体的技术还可能被用于其他领域。
科学性、先进性
- 以往人工噬菌体构建研究受到病毒本身的限制，相关研究较少，集中在还原野生型噬菌体。 本研究首次提出了一种人工构建噬菌体的技术。本研究中，我们选择的噬菌体是与水中常见的污染病毒如肠道病毒的构造相对较为近似的噬菌体phiX174。其基因组是第一个被测序的DNA基因组。我们将在野生型的phiX174基因组中插入一段较短的DNA序列，那样我们就可以通过PCR或免疫印记等方便的方法将它们从水中其他病毒中区别出来。通过实验验证，带有Flag标签的噬菌体构建成功，其表达的Flag标签片段可位于蛋白质的C端或N端。 通过PCR检测，我们已经成功构建了带有Flag标签的人工噬菌体。同时，我们已将其用于富集系统的效率检测。实验结果表明用这种人工噬菌体检测富集系统的富集效率是可行的，同时也说明这种人工构建噬菌体的技术也是可行的。
获奖情况及鉴定结果
- 无
作品所处阶段
- 实验室阶段
技术转让方式
- 无
作品可展示的形式
- 实物、产品，图片，样品
使用说明,技术特点和优势,适应范围,推广前景的技术性说明,市场分析,经济效益预测
- 用指示噬菌体指示富集系统的富集效率方法简单，在富集前定量加入该指示噬菌体，通过过滤、絮凝、吸附等方法进行水体病毒富集后，用特征引物结合Real-time PCR检测该指示噬菌体的回收率，就可以评判富集体系的效率。若一种富集体系的回收率达到70%以上，则认为该富集方法很有效。除了用于富集效率的评估，也可以用于评估饮用水制备过程中对病毒的清除效果。这些方法简单高效，可行性较强。 本项目具有很广阔的应用前景。据报道，大约有40种病毒传染病可通过水而传播。水体污染物的富集在水体整个净化处理过程中都起到了非常重要的作用，所以构建人工指示噬菌体检测富集效率能够更准确的提供水中还有的污染物的含量信息。 尽管有很多富集方法都尽量减少核酸的损失，但缺少一种定量的评估体系来判断一种富集方法造成的核酸损失率的大小。通过构建带有标记的噬菌体可以建立水体富集或者消毒的评估体系。该方法简单高效，有很大的应用价值和现实意义。
同类课题研究水平概述
- 虽然水体病毒污染的危害日益显现，但目前由于技术条件限制，病毒尚未作为饮用水水质日常监测指标。其中，缺乏安全、有效的标准品是重要原因之一。 病毒富集体系效率的检测，一般是用吸光光度法来测定的，具体来说，将加入和富集的样品用生物分光光度法定OD值，参照萨姆布鲁克等(2002)公式，计算OD260／OD280值与RNA浓度(以肠道病毒为例，RNA浓度=OD260×稀释倍数×400lag／m1)。但是，这种方法有人为因素和仪器误差的缺陷；第二，具有该吸收波长的物质不仅仅是实验对象；第三，该方法没有特异性，不能将待测对象与环境中存在的病毒区分开来。而本研究构建的重组噬菌体，能够与环境中本身存在的噬菌体很好的区分开来，避免了以上误差。同样，采用野生型噬菌体或人类病毒等作为指示，常易与环境中已有的病毒混淆，同时存在安全隐患。这一课题构建的重组噬菌体可以成为水体病毒富集检测的指示噬菌体和标准品，用于水质日常监测的实践。 构建重组phiX174也有一定的技术难度。文献检索表明，对于该噬菌体遗传研究主要限于突变体的分析，尚未有人工构建重组噬菌体的成功报道。本课题研究中通过选择合适的克隆位点，比较不同的标签序列等，在构建重组噬菌体方面取得了进展。
