基本信息
- 项目名称：
- 一种骨性材料病理制片方法：半固体脱钙技术
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 科技发明制作A类
- 简介：
- 骨性材料（人体自然的骨骼以及人造骨骼）被越来越多地运用到了生物医学领域，研究和观察这一材料内部的细胞是十分必要的。其重要性体现在通过观察细胞生长、状态、相互关系等情况来研究此种骨性材料的应用性能以及种植方法的可行性等等。本发明针对于现有技术的缺点探索出一种新型骨性材料病理制片方法—半固体脱钙技术，去除钙却又不破坏其原有细胞的特性、位置及相互关系。
- 详细介绍：
- 本发明的目的在于克服上述现有技术的缺点，即在骨性材料脱钙的同时，将其中的细胞保持在原位并且保持原有形态（不破坏胶原等有形物质支撑）和荧光。运用自行研制的脱钙剂及半固体复型剂使骨组织形成半固体状态，类似于胶质，去除钙却又不破坏其原有细胞的位置及相互关系。 运用本发明可使细胞在原位生长，并且保持原有的形态和荧光，可以清楚地对细胞进行观察和研究。运用此法脱钙后的骨性材料经速冻固化，获得的冰冻切片无需后固定，可以直接用于荧光显微镜观察，或者进行普通组化染色、免疫组化以及电镜观察等；甚至将不同层面的图像整合，相互叠加印证，可实现三维重建。避免了运用脱钙石蜡包埋法或者不脱钙塑料包埋法造成的抗原抗体反应抑制和荧光的淬灭，同时避免了不脱钙冰冻切片方法的各种缺点，节约了成本，提高了效率。方法简单、方便，利用易得的仪器和试剂，实现半固体脱钙和切片观察，实现某些常规方法无法完成的脱钙和观察。
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作品专业信息
设计、发明的目的和基本思路、创新点、技术关键和主要技术指标
- 骨性材料（人体自然的骨骼以及人造骨骼）被越来越多地运用到了生物医学领域，而作为骨性材料应用的基础和前提，研究和观察这一材料内部的细胞是十分必要的。其重要性体现在通过观察细胞生长、状态、相互关系等情况来研究此种骨性材料的应用性能以及种植方法的可行性等等。 除上述原因外，荧光蛋白基因标记技术广泛运用迫切需要一种新的制片方法来配合。但是目前罕有报道能在骨性材料内部清晰地观察到荧光细胞——由于在常规脱钙、病理制片（包括制备电镜标本）时，荧光极易消失；骨磨片虽然可以保留荧光，但解剖结构显示不清；而硬组织切片不仅需要特殊设备和技术，且操作不便、切片较厚，所获信息有限；尤其当细胞和骨生物支架材料复合的初期，由于缺乏胶原等有形物质支撑，常规脱钙会导致材料崩解，无法观察组织结构和细胞形态，并导致荧光淬灭。由于上述原因，荧光蛋白基因标记这一先进的方法难以运用到骨性材料内部细胞的观察上。 但是由于目前研究手段的限制，观察骨性材料内部的细胞成为了公认的难题。其困难性体现在：（1）天然骨骼的质地坚硬且折光性差，即使脱钙也会造成组织松散，不易观察（3）人造骨骼（现在多用β-TCP、组织衍生骨或者珊瑚骨等）虽然含有较远成分可以脱钙，但是细胞在处理过程中容易变形或者移位，不利于观察，不能真实反映细胞的生长情况既相互关系等。（2）被荧光标记的细胞在处理过程中容易导致荧光淬灭。
科学性、先进性
- ：（1）在骨性材料脱钙的同时，将其中的细胞保持在原位并且保持原有形态和荧光。（2）半固体脱钙结束后可经速冻固化，获得的冰冻切片后，进行荧光显微镜或激光共聚焦显微镜的直接观察和拍照。（3）可进行免疫组化染色和拍照，了解细胞间抗原表达情况，（4）可进行HE染色或其它染色，再获得清晰细胞显微图像，（5）必要时还可以进行电镜观察，了解超微结构变化等。以上图像可以通过电脑重叠分析，将连续的冰冻切片数据依次整合，则可以获得详细的三维立体数据。（6）所涉及的制剂、制片设备相对硬组织切片机价格便宜、容易获得，节约了制片成本，而显微结构显示良好，因此具有良好经济效益和应用前景。
获奖情况及鉴定结果
- 1、《一种骨植入材料的脱钙方法》，已提出专利申请，申请号：201010019515.8 2、Shan Jiang, Qian-li Jiang ,Yang Zhang , Le Li , Pei-ran Zhao,Yan-fei Pan,Wei Chang, Luan-jia Liu, Guo-xian Pei《Why we need semisolid decalcification system in bone tissue engineering? A story begins with honeycomb》，Medical hypotheses，75（2010）225-228【IF 1.416】 3、（15th欧洲血液学年会2010会议文摘）Jiang Qianli, Jiang S, Zhang Y, Li L, Zhao PR, Pan YF, Chang W, Liu LJ , Yu GN, Wang HM《SEMI-SOLID DECALCIFICATION AND RESEARCH SYSTEM: A NOVEL METHOD TO STUDY FLUORESCENCE PROTEIN GENE MODIFIED STEM CELLS IN BONE》
作品所处阶段
- 专利申报阶段
技术转让方式
- 无
作品可展示的形式
- 照片、图片、实物、影响
使用说明,技术特点和优势,适应范围,推广前景的技术性说明,市场分析,经济效益预测
- 本发明的优势在于：（1）在骨性材料脱钙的同时，将其中的细胞保持在原位并且保持原有形态和荧光。（2）半固体脱钙结束后可经速冻固化，获得的冰冻切片后，进行荧光显微镜或激光共聚焦显微镜的直接观察和拍照。（3）可进行免疫组化染色和拍照，了解细胞间抗原表达情况，（4）可进行HE染色或其它染色，再获得清晰细胞显微图像，（5）必要时还可以进行电镜观察，了解超微结构变化等。以上图像可以通过电脑重叠分析，将连续的冰冻切片数据依次整合，则可以获得详细的三维立体数据。（6）所涉及的制剂、制片设备相对硬组织切片机价格便宜、容易获得，节约了制片成本，而显微结构显示良好，因此具有良好经济效益和应用前景。 由于本发明正处于专利申请阶段，具体制作方法此处就不便具体说明。 由于本发明经济效益高，较目前的制片方法节约了大量制片费用；材料易得以及过程简单，一般实验室均可完成制片过程。根据目前制片过程，可运用于骨性材料生物学特性实验室研究、病理诊断等研究或医疗方面，
同类课题研究水平概述
- 骨性材料被越来越多地运用到了生物医学领域，而作为骨性材料应用的基础和前提，研究和观察这类材料内部的细胞的生长、状态、相互关系等情况，来研究各种种植方法的可行性，以及此种骨性材料的应用性能和前景等。比如在骨组织再生工程中，种子细胞需预先负载入骨生物支架材料后再植入体内，因此也必须了解进入骨性材料的种子细胞如何先存活，进而增殖分化，即了解此种骨性材料的生物相容性等。 荧光蛋白基因标记的应用使细胞的观察到达了一个新的时代。但是目前罕有报道能在骨性材料内部清晰地观察到荧光细胞。 由于研究手段的限制，观察骨性材料内部的细胞成为了公认的难题。其困难性体现在：（1）天然骨骼和人造骨骼（现在多用β-磷酸三钙/β-TCP、组织衍生骨或者珊瑚骨等）的质地坚硬且折光性差，人造骨骼不含胶原，故常规脱钙会导致组织崩解、细胞无处附着；天然骨骼虽然含有胶原成分，但脱钙也可能造成组织松散、细胞变形或移位，不利于观察，不能真实反映细胞的生长情况既相互关系等；（2）被荧光标记的细胞在处理过程中容易导致荧光淬灭。 现阶段对于骨性材料的处理有三种主要途径：一是脱钙石蜡包埋；二是不脱钙塑料包埋；三是不脱钙冰冻切片。其中，由于骨性材料的特殊性——由坚硬的骨小梁和柔软的髓质（细胞团等）组成，为了能切割出完整的半薄切片，方便观察，又以一致地软性（脱钙石蜡包埋）或一致的硬性（不脱钙塑料包埋）为主。但长期以来，文献上对这两类技术颇有争议。常规石蜡包埋难免存在一些热损伤；而一般的塑料包埋半薄切片也会明显抑制抗原抗体反应，使之无法进行免疫组织化学染色的观察和研究。鉴于以上情况，某些实验室就乐于在冰冻切片上进行常规染色和免疫标记染色的观察，但是不脱钙的骨组织冰冻切片很罕见，需要特制仪器，费用十分高昂，仅见日本有个别报道。 蒲权教授的塑料包埋技术是经改良的，其制备的塑料切片可以进行各种免疫组化（抗原抗体）反应，但也存在一些问题：（1）只适用于小组织（直径2-3mm以下），如用于更大组织则需要特殊的硬组织切片机（这种仪器在国内只有少数单位有用，且费用较高）；（2）塑料包埋剂在常规条件下无法充分进入材料内部，因而材料内部形成气泡，切片时会导致材料和材料上的细胞崩解丢失；（3）无法观察荧光细胞，其所用的固定剂可使GFP或RFP等的荧光消失。
