基本信息
- 项目名称：
- 发酵法L-精氨酸的提取及其α-酮戊二酸盐的制备
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 科技发明制作A类
- 简介：
- 在发酵法L-精氨酸的研究基础上，重点开展产物的高效提取和制备工艺研究，开发具有增强肌肉力量、排毒护肝和调节免疫等功能的L-精氨酸α-酮戊二酸盐的新型制备工艺。
- 详细介绍：
- L-精氨酸是重要的药用氨基酸，具有重要的生理生化意义，在食品、医药工业中应用广泛；L-精氨酸是尿素循环中的重要物质，补充精氨酸能够增加肝脏中精氨酸酶活性而有助于氨排放，另外其作为前体物质参与重要信使物质NO的生物合成而具有重要的生理功能；L-精氨酸α-酮戊二酸盐(AKG)是一种重要的L-精氨酸功能性衍生物，其作为功能性营养强化剂和护肝药物，能促进肌肉的快速增长和恢复，促进和维持肝脏的正常功能。 L-精氨酸是发酵法氨基酸生产中的瓶颈品种，高产L-精氨酸基因工程菌在发酵过程中氧需求量大。基于代谢代谢流量分析，提出两步供养策略，应用新的供养方式L-精氨酸产量提高16%，发酵周期缩短6h；通过增加搅拌器数量和搅拌器组合方式，改变了无菌空气在发酵培养基中的路径和分布，从而改善了气液传质和减少了发酵过程中泡沫的产生，使得精氨酸产量提高了5%；控制发酵培养基中基质的初始浓度和最佳流加方式，初始糖浓度为100 g/L时，在发酵至24h时以2.5g/h的恒速流加葡萄糖至88h结束，最终产酸较对照组提高了27.5%。pH控制在偏酸性的条件下也有利于产酸。 使用氨基酸通用提取工艺L-精氨酸的发酵后提取率一般小于70%。课题研究了不同絮凝剂对菌体絮凝的作用，结果表明调节体系pH在4时，400mg/L壳聚糖作为絮凝剂，絮凝率Rf= 99.3%； L-精氨酸目前主要采用离子交换方式进行纯化，项目通过组合不同的膜分离过程实现对其进行纯化。L-精氨酸属于两性电解质，其等电点为10.76，当调节发酵液体系pH大于10.76时，溶液中L-精氨酸呈负电荷，利用合适孔径的纳滤膜可以实现L-精氨酸的高效截留达到浓缩目的；发酵液用壳聚糖絮凝、过滤除菌体后再超滤，滤液用MWCO 400-800Da的纳滤膜进行脱色，透过液用MWCO 100-200 Da纳滤膜纳滤除盐和浓缩，体积浓缩一半时L-精氨酸表观截留率>81.0%。利用反渗透膜分离浓缩，L-精氨酸表观截留率>97%。 利用L-精氨酸和α-酮戊二酸发酵液制备AKG的研究中，分别研究了不同比例对产物成分的影响，实验结果表明L-精氨酸：α-酮戊二酸以5:4的摩尔比反应后结晶产物中两种化合物的比例接近1:1，产率达到94%。研究溶媒体系对结晶的影响，结果表明4倍体积甲醇有利于结晶。 项目提出利用膜分离技术对发酵产物L-精氨酸和L-精氨酸α-酮戊二酸盐进行浓缩，浓缩液直接结晶同步制备产物精酮合剂。混合L-精氨酸和α-酮戊二酸的发酵液，采用MWCO小于α-酮戊二酸分子量的纳滤膜对混合过滤液进行纳滤，基于分子筛效应而截留α-酮戊二酸，浓缩液中同时含有L-精氨酸和α-酮戊二酸，节省了生产成本，且浓缩液可以直接用于结晶制备产物精酮合剂，实现L-精氨酸提取和精酮合剂的同步制备。 项目目前正在进行精酮合剂AKG的生理功能性评价实验。主要以小鼠为研究对象，研究其对肝脏损伤和体能改善的影响。
作品图片
作品专业信息
设计、发明的目的和基本思路、创新点、技术关键和主要技术指标
- 目的： 在发酵法L-精氨酸的研究基础上，重点开展产物的高效提取和制备工艺研究，开发具有增强肌肉力量、排毒护肝和调节免疫等功能的L-精氨酸α-酮戊二酸盐的新型制备工艺。 基本思路： (1) 通过对L-精氨酸的中试发酵工艺研究，熟化L-精氨酸的高产发酵工艺； (2) 重点开展L-精氨酸的后提取技术研究，并开展L-精氨酸α-酮戊二酸盐（AKG）的同步制备工艺研究。 技术关键： (1) 面向中试的L-精氨酸高产发酵工艺。拟通过培养基营养成分的调整或限制性供应，使菌株在良好的生理状况下维持较高的产酸水平； (2) 节能减排型L-精氨酸的提取分离过程。充分利用产物L-精氨酸的特点，应用先进的分离装备、分离介质以及分离理念，减少提取过程的物耗、能耗和污染物排放；利用先进的膜分离技术，代替传统的离子交换方法； (3) 组成可控的AKG同步制备技术。如何选择合适的生产工艺用于控制L-精氨酸和α-酮戊二酸的合成比例，这也是项目拟解决的难点之一。 技术指标： (1) 面向中试的L-精氨酸高产发酵工艺。完成50L规模的发酵产酸试验，预期产酸水平能够达到5%以上，达到国内先进水平; (2) 节能减排型L-精氨酸的提取分离过程，总收率达到85%，达到国内先进水平; (3) 组成可控的AKG同步制备技术，产品纯度>99.0%，达到国际原料药标准。
科学性、先进性
- 作品科学性先进性如下： (1) L-精氨酸高产发酵工艺。不同供氧条件下的L-精氨酸发酵特性的研究结果表明，发酵生产L-精氨酸对供氧有较高的要求。提出了两步法供氧控制策略，该策略先在发酵的初始阶段维持高供氧条件，然后控制搅拌转速稳步下降，以维持一个稳定的溶氧改变。 (2) 节能减排型L-精氨酸的提取分离过程。L-精氨酸是一种碱性氨基酸，根据其理化性质，系统研究高效絮凝、离子交换和洗脱方式对产物提取效率的影响。 (3) 组成可控的AKG同步制备技术。由于L-精氨酸和α-酮戊二酸的不同组成比例具有不同的生理功能，所以提出发酵产物L-精氨酸提取与α-酮戊二酸盐同步制备工艺，并能实现组成比例的精确控制。 (4) 膜分离提取L-精氨酸和 L-精氨酸α-酮戊二酸盐。针对产物浓缩工艺，应用膜法分离提取产物L-精氨酸和 L-精氨酸α-酮戊二酸盐，高度浓缩的样品能直接进行结晶获得产物。
获奖情况及鉴定结果
- 无
作品所处阶段
- 中试阶段
技术转让方式
- 技术转让
作品可展示的形式
- 实物、产品；图片；样品
使用说明,技术特点和优势,适应范围,推广前景的技术性说明,市场分析,经济效益预测
- 氨基酸产业是生物产业的支柱之一，也是生物技术产业中最具活力的领域之一，围绕氨基酸的生物制造进行选题符合宏观的产业导向。我国政府非常重视生物产业的发展，《国家中长期科学和技术发展规划纲要》已明确把生物产业作为战略性新兴产业予以发展和支持。 精氨酸是我国发酵氨基酸的瓶颈品种，其产业技术一直是生物技术领域的难题。项目技术面向发酵法氨基酸制造的下游产业，旨在促进技术向生产力的转化。相关研究内容直接来源于氨基酸制造行业的需求，其突破将显著提高我国L-精氨酸的生产水平和能力。 Ｌ-精氨酸是合成或配制医药、保健品、化妆品、食品、香料的重要原料，存在较大的市场供给缺口，产品市场前景广阔。采用发酵法制备的L-精氨酸及其α-酮戊二酸盐，可以进一步促进精氨酸在相关行业的应用。 本项目研究以精氨酸酮戊二酸盐单一制剂为研究对象，每粒胶囊含复合物250mg、每瓶100粒（即每瓶25g）。10吨/年发酵法复合物（10,000,000g）可生产0.4亿粒，即40万瓶。
同类课题研究水平概述
- 1. 产业发展现状 L-精氨酸具有重要的生理生化意义，在食品、医药工业中有广泛的应用。目前，采用发酵法生产L-精氨酸，例如日本味之素、日本协和发酵、韩国大象是产量较大的企业，占据了全球药用级精氨酸的主要市场。L-精氨酸的市场需求呈快速增长状况，国内外年需求量已达到1.3万吨以上，产品的消费主要集中在欧美日等发达国家。我国的需求量从本世纪初的200吨已增加到现在的2500吨，而产量不到1200吨。与此同时，国际市场上L-精氨酸延伸产品，在食品、医药产品中应用也逐渐升温，N.O.-XPLODE在美国成为销量第一的氮氧类产品。 2. 技术现状和发展趋势 L-精氨酸是世界上公认的发酵法中的瓶颈氨基酸，其原因主要在于代谢路线复杂，路径长，细胞积累困难。目前很多构建好的工程菌往往在实验室阶段具有较好的产酸水平，但达不到产业化要求，产业化实施的并不多。 我国开展发酵法精氨酸的生产时间较短产业经验较少，而在精氨酸的发酵后提取方面，很多工艺依然沿用的是氨基酸通用提取工艺，提取率一般在70%以下。围绕着提高提取收率和产物纯度方面，我国学者也提出了众多解决思路。如ZL03132309提供了一种沉淀法提取精氨酸的工艺，收率达到了80%以上，但过程使用了大量的十二烷基苯磺酸盐。 在精氨酸衍生物的开发方面，近年不断涌现出不同衍生物及其新型制备工艺，主要集中在如下几个方面：一是与酮戊二酸配位成盐，强化对TCA循环及精鸟循环的推动，发挥一氧化氮的信号载体作用和肝脏解毒功能。二是与多糖、维生素、有机酸或天然活性产物形成精氨酸缀合物，既发挥精氨酸的一氧化氮的载体作用，又强化配位物质的活性。三是作为乙酰化修饰产物，主要作为激素类药物的载体，如JP2002-004666所述的各类精氨酸衍生物，主要提供对促黑激素（MC4）受体具有亲和性及特异性的肽型配体；CN1390832A提出的创新构型化合物N，N’-二乙酰胱氨酸精氨酸主要用于对肝病、慢性感染病以及自身免疫疾病的治疗。 因此，精氨酸衍生物的开发是国内外竞相开发的热点，而AKG则是药理作用相对明确、国外市场相对成熟的产品之一。我国对其制备工艺研究不多，目前仅有一片专利相关（一种α-酮戊二酸-精氨酸盐制剂的制备方法及在治疗肝病中的应用, 中国专利, 200710063479。）
