基本信息
- 项目名称：
- 高产紫杉醇菌株的诱变选育及其差异表达基因消减cDNA文库的构建
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 本研究分别采用硫酸二乙酯和紫外线与硫酸二乙酯复合诱变处理菌株HD1-3孢子，选育到了1株遗传性状稳定、高产紫杉醇突变株；成功地构建了高产紫杉醇菌株UD14-11与菌株HD1-3差异表达的cDNA消减文库，为寻找、分离微生物生物合成紫杉醇相关基因和利用基因工程或代谢工程手段定向设计改造菌株奠定基础。
- 详细介绍：
- 紫杉醇（taxol）是一种复杂的具有抗癌活性的三环二萜类化合物。微生物发酵法是可以无限生产、大量获取紫杉醇的很有前景的方法。但目前利用内生真菌发酵生产紫杉醇基本处于试验阶段，离工业化大规模生产还有相当大的距离，主要限制因素是筛选到的菌株产量太低和缺乏内生真菌紫杉醇生物合成的分子生物学基础研究，因此，高产菌株的选育成为当前的首要任务。 本研究分别采用硫酸二乙酯和紫外线与硫酸二乙酯复合诱变处理菌株HD1-3孢子；以选育到的高产紫杉醇菌株为tester，菌株HD1-3为driver，应用抑制性消减杂交技术构建选育到的高产紫杉醇菌株与菌株HD1-3差异表达的cDNA消减文库。试验结果表明，本试验确定了Nodulisporium sylviforme紫杉醇产生菌HD1-3孢子复合诱变的适宜条件，成功地构建了高产紫杉醇菌株UD14-11与菌株HD1-3差异表达的cDNA消减文库，文库滴度为1.2×107 cfu/mL，阳性克隆率75.3 %，片段大小主要集中在300 bp－1.0 kb。本试验研究为寻找、分离微生物生物合成紫杉醇相关基因和利用基因工程或代谢工程手段定向设计改造菌株奠定基础。
作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 主要目的是选育高产紫杉醇菌株，并构建选育到的高产紫杉醇菌株与出发菌株HD1-3差异表达的cDNA消减文库。 分别采用硫酸二乙酯和紫外线与硫酸二乙酯复合诱变处理菌株HD1-3孢子；以选育到的高产紫杉醇菌株为tester，菌株HD1-3为driver，应用抑制性消减杂交技术构建选育到的高产紫杉醇菌株与菌株HD1-3差异表达的cDNA消减文库。
科学性、先进性及独特之处
- 合成紫杉醇的主要限制因素是筛选到的菌株产量太低和缺乏分子生物学基础研究。本试验为选育高产紫杉醇菌株及其合成提供了独有的研究材料。国内外尚未发现有分离紫杉醇生物合成相关基因的报道。微生物合成紫杉醇相关基因的分离及其功能分析是构建高产紫杉醇基因工程菌株的重点。试验为寻找、分离微生物生物合成紫杉醇相关基因和利用基因工程或代谢工程手段定向设计改造菌株奠定基础。
应用价值和现实意义
- 选育到了遗传性状稳定、高产紫杉醇的突变株，成功地构建了高产紫杉醇菌株UD14-11与菌株HD1-3差异表达的cDNA消减文库，为寻找、分离微生物生物合成紫杉醇差异表达相关基因和利用基因工程、代谢工程手段定向设计改造菌株奠定基础。为内生真菌与其宿主相互关系的研究提供新的证据与思路。本试验为早日实现生产紫杉醇的工业化生产向前迈进了一大步。故本研究具有一定的科学意义和潜在的推广应用前景。
学术论文摘要
- 目的：选育高产紫杉醇菌株并构建选育到的高产紫杉醇菌株与出发菌株HD1-3差异表达的cDNA消减文库。方法:分别采用硫酸二乙酯和紫外线与硫酸二乙酯复合诱变处理菌株；以选育到的高产紫杉醇菌株为tester，菌株HD1-3为driver，应用抑制性消减杂交技术构建选差异表达的cDNA消减文库。结果：试验确定的紫杉醇产生菌HD1-3孢子复合诱变的适宜条件为：将106 cfu/mL孢子悬液经过8 %硫酸二乙酯处理15 min后，在电磁搅拌下，用紫外灯照射处理45 s，获得了1株遗传性状稳定、高产紫杉醇的突变株——UD14-11，其紫杉醇产量从出发菌株HD1-3的232.73±4.61 µg/L提高至312.81±7.51 µg/L；构建的文库滴度为1.2×107 cfu/mL，阳性克隆率75.3 %，片段大小主要集中在300 bp－1.0 kb。结论：选育到了1株遗传性状稳定、高产紫杉醇突变株；成功地构建了高产紫杉醇菌株UD14-11与菌株HD1-3差异表达的cDNA消减文库，为寻找、分离微生物生物合成紫杉醇相关基因和利用基因工程或代谢工程手段定向设计改造菌株奠定基础。
获奖情况
- 无
鉴定结果
- 无
参考文献
- 1.张惠展. 途径工程—第三代基因工程. 北京：中国轻工业出版社，2002. 2.张蓓. 代谢工程. 第一版. 天津：天津大学出版社，2003. 3.刘文，唐功利. 以生物合成为基础的代谢工程和组合生物合成. 中国生物工程杂志 4黄薇, 方孝东, 赵文明, 林栖凤. 分离差异表达基因的方法. 生物工程学报（Chinese Journal of Biotechnology）, 2002, 18（4）：521-524. 5沈萍，范秀容，李广武. 微生物学实验（第三版）. 北京：高等教育出版社，1999. 6赵凯，周东坡，平文祥，刘军，马玺，金涛. 产紫杉醇菌株原生质体诱变育种的研究. 生物工程学报（Chinese Journal of Biotechnology），2005，21（5）：848-851.
同类课题研究水平概述
- 微生物发酵合成的主要限制因素是菌株产量太低和缺乏内生真菌紫杉醇生物合成的分子生物学基础研究。本试验为选育高产紫杉醇菌株和及其合成的相关基因提供了独有的研究材料。迄今为止在国内外还尚未发现有从紫杉醇产生菌中分离到紫杉醇生物合成相关基因的报道。本试验成功地构建了高产紫杉醇菌株差异表达的cDNA消减文库，为寻找、分离微生物生物合成紫杉醇相关基因和利用基因工程或代谢工程手段定向设计改造菌株奠定基础。 紫杉醇是近年来世界范围内抗肿瘤药物研究领域的重大发现。在1856年，Lucas H就从欧洲红豆杉叶片中提取到粉末状碱性物质，即紫杉碱。1963年美国化学家首次从一种生长在美国西部大森林中称谓太平洋杉树皮和木材中分离到了紫杉醇的粗提物。紫杉醇粗提物对离体培养的鼠肿瘤细胞有很高活性，并开始分离这种活性成份。世界上进行紫杉醇全合成研究的小组有30多个，美国佛罗里达州立大学的化学教授毫顿等在此方面一直处于领先地位，于1993年12月9日完成紫杉醇全合成。全合成紫杉醇的成功为研究人员开发生产紫杉醇提供了又一条可行的途径。 用生物技术生产紫杉醇的研究：利用植物细胞培养法生产紫杉醇，是各种研究方向中十分有吸引力的一个方向，利用生物技术生产紫杉醇，具有不破坏自然环境、不受自然条件限制的优点，是解决紫杉醇来源的一条重要途径。 紫杉醇发展的趋势：目前国内外对紫杉醇的研究方向很多，但仍没有比较成型的可进行工业化生产，主要原因：①从红豆杉树中提取紫杉醇资源不足，又破坏生态环境，无法持续生产；②红豆杉的种繁、栽培与扦插尽管可以解决优选、优育、高产的问题，但该种树生长非常缓慢，远水不解近渴，难负重望；③化学合成与半合成则因紫杉醇的化学结构复杂、分子量相对较大，很难进行工业化生产；④细胞培养法则因为发酵周期长且新的高产细胞株选育耗时长，中试投产有一定的困难，解决工业化大生产更需长时间研究。笔者认为紫杉醇未来的发展趋势主要有以下两方面。 微生物发酵法生产紫杉醇的关键问题是紫杉醇产生菌的分离和发酵液中紫杉醇产量的提高，目前还有许多技术关键问题需要解决。相信在不久的将来，选取优良的紫杉醇产生菌为出发菌株，通过诱变育种、细胞工程或基因工程手段进行改造，从而筛选得到高产工程菌株用于工业化生产，完全可以彻底解决紫杉醇来源的危机。
