基本信息
- 项目名称：
- 韦伯灵芝新漆酶基因的分离及其工程菌的构建
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，催化的底物种类广泛，在工业生产、环境保护和食品加工等方面具有巨大的应用潜力。目前阻碍漆酶商业化应用的重要因素是缺少大量廉价的酶源供应。因此，可通过克隆漆酶基因进行高效率的异源表达，解决工业用漆酶供应来源的问题。本项目以自主选育的具有知识产权且漆酶产量特高的灵芝菌株TZC为材料，克隆新的高效表达的漆酶基因并构建具有高效分泌表达能力的漆酶基因工程菌。
- 详细介绍：
- 漆酶(Laccase, EC1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶，能够氧化多种芳香化合物和其它有机化合物，并使氧气还原生成水。漆酶催化的底物种类广泛，因此在工业生产、环境保护和食品加工等方面具有巨大的应用潜力。本研究是以自主选育的具有知识产权且漆酶产量特别高的灵芝菌株TZC为实验材料，根据漆酶铜离子保守结构域的氨基酸序列设计一对简并引物，通过一步法RT-PCR技术扩增出1.2kb的DNA片段，扩增产物经测序验证后，推测为漆酶基因的部分编码序列；接着以该部分序列为基础，进行5′-RACE和3′-RACE扩增技术，成功分离到韦伯灵芝漆酶基因的全长DNA序列，命名为GW-lac1。该基因序列分析表明，基因长2385bp，ORF为为1566bp，编码521个氨基酸；编码的蛋白含有3个保守的铜离子结合域，与已知松杉树芝(Ganoderma tsugae)的漆酶LAC1(ABK59825.1)的同源性最高为76%。为了进一步研究GW-lac1编码的漆酶功能，将GW-lac1编码区（CDS）定向插入酵母表达载体pPICZ的AOX1启动子下游，通过电激法转化到毕赤酵母GS115菌株中，转化子经博来霉素抗性和菌体直接PCR筛选，成功构建了含有GW-lac1的基因工程酵母菌，该工程菌可进行发酵培养，分离异源表达的漆酶蛋白，为有关漆酶和漆酶基因的利用奠定了坚实的基础。
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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 撰写目的：以灵芝菌株TZC为材料，克隆新的高效表达的漆酶基因并构建具有高效分泌表达能力的漆酶基因工程菌，可以加速漆酶及其应用的产业化进程。作品基本思路：提取TZC总RNA，设计简并引物进行一步法RT-PCR扩增，得到一个新漆酶基因部分编码序列；再进行染色体步移，获得全长DNA序列；设计克隆引物，将新基因的编码区克隆到毕赤酵母表达载体,转化毕赤酵母GS115菌株，通过分子筛选，成功构建异源表达载体。
科学性、先进性及独特之处
- 作品的科学性：实验方法均是基因工程领域近期发明的先进克隆技术，研究结果经过限制性内切酶酶切验证和DNA测序验证，可信度高。作品的先进性：本作品是国内外首次从食用和药用大型真菌韦伯灵芝发酵菌丝中成功克隆到的新漆酶基因，可以向中国专利局申请新基因的专利。作品的独特之处：以自主选育的具有知识产权且漆酶产量特别高（8,620,830 U/L）的灵芝菌株TZC为实验材料，其它类似作品无法复制本实验的成果。
应用价值和现实意义
- 作品实际应用价值：从具有知识产权且漆酶产量特别高的灵芝菌株出发，克隆该高产漆酶的基因，可以申请新漆酶基因的专利；新漆酶基因定向整合到毕赤酵母菌的基因组中，成功构建了含有新漆酶基因的工程酵母菌，该工程菌可用于工业发酵生产商品漆酶，增加漆酶发酵工艺的多样性，加速漆酶及其应用的产业化进程。作品的现实意义：本作品的开展对大学生的专业学习兴趣的培养、创新思维能力的训练以及动手实践能力的提高都是非常重要的。
学术论文摘要
- 漆酶(Laccase, EC1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶，催化的底物种类广泛，因此在工业生产、环境保护和食品加工等方面具有巨大的应用潜力。本研究以自主选育的具有知识产权且漆酶产量特别高的灵芝菌株TZC为实验材料，根据漆酶铜离子保守结构域的氨基酸序列设计一对简并引物，通过一步法RT-PCR技术扩增出1.2kb的DNA片段，推测为漆酶基因的部分编码序列；以该部分序列为基础，进行染色体步移，成功分离到韦伯灵芝漆酶基因的全长DNA序列，命名为GW-lac1。该基因序列分析表明，基因长2385bp，ORF为为1566bp，编码521个氨基酸；编码的蛋白含有3个保守的铜离子结合域，与已知松杉树芝(Ganoderma tsugae)的漆酶LAC1(ABK59825.1)的同源性最高为76%。为了进一步研究GW-lac1编码的漆酶功能，将GW-lac1编码区定向插入酵母表达载体pPICZ的AOX1启动子下游，通过电激法转化到毕赤酵母GS115菌株中，转化子经博来霉素抗性和菌体直接PCR筛选，成功构建了含有GW-lac1的基因工程酵母菌，该工程菌可进行发酵培养，分离异源表达的漆酶蛋白。
获奖情况
- 荣获第十二届“挑战杯”全国大学生课外学术科技作品竞赛广州大学校赛一等奖。
鉴定结果
- 第十二届“挑战杯”全国大学生课外学术科技作品竞赛广州大学校赛一等奖作品。
参考文献
- 1.田长恩,周玉萍,陈琼华.一种产漆酶的灵芝菌株.发明专利申请号:200810198678.X 2.陈琼华,周玉萍,毕凡星,程惠贞,田长恩.漆酶高产菌株的筛选.广州大学学报(自然科学版)，2009， 7(5):53-57. 3.陈琼华,周玉萍,陈 晓,柯德森,程惠贞,田长恩.韦伯灵芝漆酶的分离纯化及其性质研究.食品科学，2010，31(5):201-205. 4.居乃琥.酶工程研究和酶工程产业的新进展（Ⅰ）— 国际酶工程研究领域的若干“热点”和前沿课题。食品与发酵工业, 2000,26:54-62. 5.居乃琥.酶工程研究和酶工程产业的新进展（Ⅱ）— 国内外酶制剂工业的现状、发展趋势和对策建议。食品与发酵工业, 2000,26(4):38-62. 6.刘志明，郭丽琼，林俊芳.真菌漆酶异源表达研究进展. 中国生物工程杂志，2009,29(6):135-142. 7.涂宁宇,陈松明.产生木质素降解酶的白腐菌的研究进展.造纸科学与技术，2006，25:27-31. 8.赵敏，朱琳，魏巍.木腐菌氧化酶系检定及漆酶产生的研究.菌物学报, 2009, 28: 244-252 9.周宏敏，洪宇植，肖亚中，蒲春蕾.栓菌漆酶在毕赤酵母中高效表达及重组酶的性质.生物工程学报, 2007,23:1055-1059. 10.王勇.毕赤酵母表达外源基因研究进展.微生物学免疫学进展,2004,32(1):62-66. 11.张银波,姜琼,江木兰等.金针菇漆酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达研究.微生物学报，2004，44:775-779. 12.Baldrian P. Fungal laccases - occurrence and properties. FEMS Microbiol. Rev, 2006 ;30(2):215-242. 13.Riva KA, Plou F J, Ballesteros A, Alcalde M. Laccases and their applications: a patent review. Recent Pat Biotechnol, 2008, 2(1):10-24. 14.
同类课题研究水平概述
- 漆酶（Laccase，EC1.10.3.2）是一种含铜的多酚氧化酶，属于蓝色多铜氧化酶家族，能够氧化多种芳香化合物和其它有机化合物，并使氧气还原生成水。不同漆酶的底物的专一性不同，其利用领域便可能不同。因此,漆酶在纸张漂白、生物修复、染料脱色、果汁与酒的澄清和纺织品的清洁等方面都具有巨大的应用潜力。随着生物技术的发展,漆酶基因已经从木素降解菌和非木素降解菌中得到克隆，并且进行了序列分析。但其编码基因一经克隆多申请知识产权保护，而且漆酶产量低，价格昂贵，因而限制漆酶的广泛应用。为了解决这些问题，分离新的漆酶基因并实现其工程菌的高效异源表达成为了有效途径。1990年Kojima首次将毛云芝（Coriolor hirsutus）的木素降解酚氧化酶进行了克隆并在酿酒酵母系统中表达；次年Markku Saloheimo等将编码白腐菌射脉菌（Phlebia radiata）漆酶基因克隆于黑曲霉表达系统中, 用纤维素酶启动子来启动该酶的表达, 表达量为20 mg/L；另外,米曲霉和毕赤酵母系统也成功地表达了若干种不同来源的漆酶。但是，真正实现漆酶的高表达还有一定的距离。本研究所采用的实验材料韦伯灵芝菌株TZC在专用发酵培养基发酵所产漆酶的活性特别高（8,620,830 U/L ，ABTS法，目前已知是白腐菌中产量最高的菌株）。以TZC菌丝体克隆得到的新漆酶基因有利于构建具有高效分泌表达能力的漆酶基因工程菌，为有关漆酶和漆酶基因的利用奠定了坚实的基础。 漆酶的应用前景非常广阔。随着研究的不断深入，人们对白腐真菌产酶机理、酶活性中心及作用机理都有了较多的了解。但仍存在不少问题,如菌株合成漆酶水平偏低，菌体生长较慢，酶催化效率低，不适于工业化生产等。因此，加强生物、化工、食品、农业等多学科交叉研究开发漆酶高表达菌株，探索酶合成代谢的影响因子及其作用规律，开拓漆酶新的应用领域和应用途径，必将具有深远的科学意义和巨大的经济价值。
