全自动生化需氧量（BOD）生物传感分析仪是利用微生物膜降解水中有机物时的呼吸作用而引起水中溶解氧的变化，通过探针测量溶解氧的浓度变化，将化学信号转化为电信号输出，从而得出测量数据的快速测定水中有机物浓度的生物传感器。该仪器主要由生物识别元件——固定化微生物膜和物理换能器——溶解氧探针组成。它不仅克服了传统测量方法测量时间长、重现性差等不足，且具有操作简便、可进行现场测量等特点。应用前景十分广阔。

全自动生化需氧量（BOD）生物传感分析仪 一、仪器的发明目的及国内外研究现状 生物化学需氧量（biochemical oxygen demand，BOD）是表示水中有机物等需氧污染物质含量的一个综合指标，它说明水中有机物由于微生物的生化作用进行氧化分解，使之无机化或气体化时所消耗水中溶解氧的总数量，其单位以mg/L表示，其值越高，说明水中有机污染物质越多，污染也就越严重。其标准测定方法为五日法，以被检验的水样在20±1℃下，5天内的耗氧量为代表，称其为5日生化需氧量。但该方法操作较复杂，耗时长，结果准确度及重现性差，无法满足当前环境监测中快速测定的要求。而日益得到广泛应用的微生物传感器法能够快速、准确测定水体中BOD，并可实现在线连续测定，更加适应于现代环境监测和管理的要求。但进口的该类型仪器一方面价格昂贵（约50万人民币左右；还须长期进口与仪器配套的生物膜）；另一方面由于我国和国外污水水质的差别，也使该仪器很难适应我国的水质条件。因此，拥有自主知识产权的BOD快速监测仪，并使其适应我国的实际使用环境，不仅具有极为广阔的市场前景，而且其技术也填补了我国环境监测的一项空白。其科研和经济价值都十分重大。为此，我们研制出了一种适合于我国水质特点并且可以快速、准确、简便测定BOD的全自动生化需氧量（BOD）生物传感分析仪。 自1983年日本将BOD传感器开发成商品，并与BOD测定仪一起出售，已使BOD快速检测仪走上标准化和商业化的轨道。后来许多公司也致力于改进和生产不同的BOD传感器，生物膜型和生物反应器型的传感器纷纷面世。现在，欧美及日本等发达国家，BOD在环境监测中已实现全自动化，但国外厂家的仪器产品价格昂贵、配件(如菌膜)购置困难，且由于我国和国外污水水质的差别，也使这些仪器很难适应我国的水质条件，使用过程中性能不够稳定。目前国内也有很多的商用BOD传感器被制造出来投放市场，但这些BOD微生物传感器产品存在着一些普遍的问题，即响应小、测量范围窄、稳定性差，至今为止，还尚未用BOD生物传感器法代替传统的五日法，其核心问题即生物膜的制备和菌种的选择与培养均未达到完善的阶段。因此，如何筛选到适应面广，符合我国水质特点的高效菌株，从而制得快速准确的BOD检测仪一直是此类课题研究的瓶颈问题。另一方面，监测工作往往需要深入现场，如何实现数据实时传输，在线检测BOD也一直是环境保护特别是水质监测中急需解决的难点问题。目前研究的热点和核心主要集中于微生物膜的研制，其中菌种选育、微生物固定化方法的选择成为研究的主要方向。 为解决目前BOD传感器存在的问题，我们着手研制全自动生化需氧量（BOD）生物传感分析仪。主要研究内容包括： 1. 通过驯化育种、诱变育种和转基因技术筛选优势菌种制膜，以解决国内目前同类产品生物膜活性低、稳定性差，适应面窄的问题； 2. 采用多通道连续进样测定，无需通过微量进样器加样，从而减少人工操作和系统误差，使传感器的性能更加稳定，且为BOD的在线测定奠定技术基础； 3. 减小仪器体积，使其可随身携带至现场测定，解决常见的取样时间和测定时间间隔过长，导致测定结果异常的问题； 4. 直接显示或打印测定结果，避免稀释法繁琐的操作和计算，提高测定的智能化程度。 二、仪器组成 全自动生化需氧量（BOD）生物传感分析仪主要由生物识别元件、物理换能器和多通道加样系统组成，其设计原理是待测物通过生物分子识别部件将被感知物质的非电信号转换成可测量的电信息，再经过放大信号处理，进行信号输出。其中识别器件主要用来感知样品中是否含有待测物质，转换器件则将识别器件感知的信号转化为可以观察记录的信号(如电流大小、频率变化、荧光和光吸收的强度等)。在待测物、识别器件以及转化器件之间由一些生物、化学、生化作用或物理作用过程彼此联系。当待测物与分子识别元件特异性结合后，所产生的复合物(或光、热等)通过信号转换器变为可以输出的电信号、光信号等，从而达到分析检测的目的。 具体来说，全自动生化需氧量（BOD）生物传感分析仪由液体切换系统、供液系统、供气系统、恒温系统、控制系统五大系统组成。其中液体切换系统由控制系统通过三个电磁阀来控制，这三个电磁阀分别控制测量、标定、清洗。供液系统是一个蠕动泵，提供液体的流转动力。供气系统给流路提供氧气。恒温系统由加热块来保证仪器中液体、气体以及生物传感器温度的恒定，使其保持在一定的温度范围，其中仪器的核心部件为生物传感器。 三、仪器的工作原理 全自动生化需氧量（BOD）生物传感分析仪的工作原理为：将微生物体固定化制作成微生物膜并作为敏感材料与氧电极紧密组合，组成分析系统，氧电极将生物膜产生的生化信号转化成电流信号，该信号经放大、处理后输出。当不给予有机底物（即处于空白溶液时）时，微生物处于内源呼吸阶段，由溶液扩散到氧电极的氧达到扩散平衡时，BOD电极输出的电流值应当达到稳态。向空白溶液中投加有机底物后，有机物被微生物膜代谢，微生物处于外源呼吸阶段，由溶液扩散到氧电极的氧逐渐降低，最终达到稳定状态。在一定条件下电流的降低值与被测试样浓度呈线性关系，由已知标准样品求出两者之间的线性关系，可测得样品的BOD浓度。 作为生物响应元件的微生物膜是传感器的核心，微生物膜性能的优劣直接影响到测试结果，因此筛选高效微生物菌种具有重要意义。其选择的原则是只要微生物在其代谢过程中允许通过电子转移系统传递电子，无论是原核生物还是真核生物都可用于构造微生物传感器。因此，在具体选择时可根据污水的具体情况而定。 本次实验采用稀释平板法经驯化育种从污水水样中分离出单菌株，挑取单个菌落于斜面培养基上培养，然后从斜面培养基的菌苔挑出少许进行划线分离，经过反复多次后获得菌落形态及菌体形态一致的纯菌种，将其染色观察，确定其为革兰氏阳性菌或是革兰氏阴性菌，再将各菌种分别添加一定量添加剂制备成微生物膜，作为生物敏感元件安装于氧电极的透气膜上构成BOD生物传感器，上机测试样品的BOD值，通过对数据的分析处理来检测微生物膜性能的优劣，从而挑选出具有广泛降解能力、性能优良、生命周期较长且处理效果稳定的微生物膜。通过一系列的对比测试试验，我们得出假单胞菌是比较适合的菌种。 四、仪器的技术参数 原理：微生物电极法；测量项目：生物化学需氧量(BOD)；测量范围：2～10000mg/L；相对标准偏差：≤5% ；一次测样时间：8min；输出信号：微生物电极0～20μA；进样方式：由蠕动泵驱动恒速流通连续进样；缓冲溶液消耗：2.5mL/min；所需样品体积：>40mL；恒温方式：由加热器保持自动恒温。 五、仪器测试流程 1. 微生物膜的活化。事先将干的微生物膜放在盛有500 mL 0.005 mol/L的磷酸盐缓冲液烧杯中浸泡7 d，然后安装到电极上，备用。 2. BOD的测定方法。以0.005 mol/L磷酸盐缓冲液(pH=7.2)为稀释液和空白溶液，控温32℃ ，恒速搅拌维持测量槽中溶解氧饱和，待传感器内源呼吸输出电流值稳定后加入待测试样，采用稳态读数法。 3. 自动打印数据，分析电流初值（反映微生物膜活性）、电流差值（微生物降解有机物能力）及其稳定性。 六、仪器的创新点 1.系统创新：此检测仪采用多通道充氧加样系统，使用变频式充气泵充氧复氧，通过芯片控制氧传感器，以保证测量池内溶解氧浓度的恒定，实现了加样与充氧的同步化，不仅解决了以往流动注射式BOD检测仪中人工加样的系统误差，而且可以保证仪器在连续测样时的系统稳定性。 2.方法创新：通过驯化育种、诱变育种等技术筛选优势菌种制膜，解决国内目前同类产品生物膜活性低、稳定性差，适应面窄的问题。 3.技术创新：仪器测定可使目前各环境监测站和污水处理厂BOD测定实现自动化，提高效率，减少人为误差，并且该仪器操作简单、体积小，可随身携带至现场测定，解决了常见的取样时间和测定时间间隔过长，导致测定结果异常的问题。 七、技术关键 1. 使用基因工程手段和传统微生物分离、纯化技术相结合，筛选适合我国水质特点的高效微生物菌株制备生物膜； 2. 将人工间断注射进样方式转变为多通道连续进样测定和分析过程，实现全自动化精确测定； 3. 改进传统的一次化学包埋制作生物膜的方法，实现二次物理包埋，在多通道充氧系统中保持微生物活性和生物膜寿命。 八、仪器的特点与优势 1. 大大缩短水体中BOD值的测量时间。经典的五日测定方法，整个测定过程需5天时间，且无法实现现场检测，而BOD微生物传感器测定速度较快，在10～20min内即可测得BOD值，并可实现连续在线测定，这无疑更适应于现代环境监测和管理的要求。 2. 测定结果准确度高。德国的Germany STIP Iso GmbH GroB-Umstadt公司利用从废水中分离出来的细菌制备生物反应型BOD传感器，测量精密度达3%。孙成新等使用流动BOD传感检测仪对5种不同来源的水样进行测量，经t-测验后发现该仪器测定结果与标准稀释法无显著差异（误差≤0.05）。 3. 测定结果重现性好。由于微生物传感器上微生物量是一定的，故只要保持微生物活性相对稳定且测定过程中其他条件不变，就能保证较高的测定重现性。林玲等（2004）实验考察了三种不同菌膜作为生物敏感元件的微生物传感器在30℃和pH值为7.2条件下连续4次测定BOD值为100 mg/L 的GGA溶液（ BOD标准溶液，由150 mg/L 葡萄糖溶液和150 mg/L 谷氨酸配制的混合溶液）的重现性，其荧光强度变化速率最大值的相对偏差分别为：2.71%，2.65%，2.2%，均在 标准分析要求的重现性范围内。Chang I. S.（2004）报导一种无需电子媒介物的微生物燃料细胞型传感器。在水力停留时间为1.02h，营养供给速率0.35 mL/min条件下，传感器的线性响应范围0～200 mg /L，恢复时间60 min。测量BOD为100 mg/L的人工废水，响应重现性标准偏差<10%。该传感器测量可稳定运行5年以上。 4. 可以测量的水质种类、浓度范围较广。可对食品加工业废水、印染工业废水、生活污水及地表水等淡水水体中BOD进行测量，且测量浓度范围较广。马莉等（2004）将从淡水中筛选出的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）驯化为适应海水测量条件的响应菌株，制得海水BOD传感器，响应线性范围0～27 mg/L，线性相关系数0.999。Chan等（1999）采用一种耐高盐度的酵母菌LS3，将其用聚氨基甲酰磺酸酯包埋后吸附到尼龙膜上。制成的BOD传感器用于测定港口和海岛地区含盐度较高的工业用水和生活污水，其测定浓度范围可达2～550 mg/L。比利时Belgium Kelma公司生产的BOD 传感器采用活性污泥制作微生物膜,其测量范围可达0～5×10 mg/L。 5. 采用变频式充气泵充氧复氧，通过芯片控制氧传感器，以保证测量池内溶解氧浓度的恒定。该设计有如下优势： ⑴无需通过微量进样器加样，减少了人工操作和系统误差； ⑵采用多通道连续进样测定，不仅使传感器的性能更加稳定，而且为BOD的在线测定奠定了技术基础； ⑶克服了传统的注射式BOD检测仪为了使溶解氧达到饱和，必须将传感器稳定于溶液表面附近，导致复氧过程中的气泡在上升后可能在传感器顶端微生物膜周围附着，产生系统误差，干扰数据准确性的弊端。多通道充氧复氧系统可以保持水中溶解氧浓度恒定，所以传感器可深入液面下，彻底消除气泡附着的现象。 九、仪器的适用范围 1.可对食品加工业废水、印染工业废水、酿造工业废水、生活污水及地表水等淡水水体中BOD进行测量，且测量浓度范围较广。 2.可以及时为管理和决策部门掌握地表水、工业废水和生活污水排放现状提供科学决策的依据，同时也为工业企业污水治理、污水处理厂的污水治理工艺设计、控制、处理效率及时提供参数。 十、推广前景 随着环境保护和计算机技术、生物膜技术、基因工程技术、半导体技术和压电晶体技术的发展，生物传感器技术也必将得到进一步发展。通过选择新的微生物物种、合成新的生物材料以及基因工程技术的引入，都将为新型生物传感器的出现提供帮助，将有助于生物传感器的微型化、便携化和实用化。 目前我国拥有数以千计的环境监测站、污水处理厂及相关科研单位，这意味着BOD的快速监测仪器具有极为宽广的应用前景。同时，基于目前环境监测要实现快速准确测定的要求以及BOD微生物传感器检测仪操作简单、检测速度快、灵敏度高、重复性好、测量稳定可靠、适用范围广等的特点，它能够为环境监测的连续性提供可能，同时降低了环境监测的成本，因此可以在各类环境保护公司，环境监测部门和环境执法部门得到广泛应用。 十一、市场分析和经济效益预测： 生物传感器商品化要具备以下几个条件：足够的敏感性和准确性、易操作、价格便宜、易于批量生产、生产过程中进行质量监测。其中，价格便宜决定了传感器在市场上有无竞争力。而在各种生物传感器中，微生物传感器最大的优点就是成本低、操作简便、设备简单，因此其在市场上的前景是十分巨大和诱人的。 目前我国研制的BOD检测仪存在着监测稳定性差，无法适应各种污水条件的缺陷。因此在很大程度上制约了它的使用范围和效果。究其根本原因在于BOD检测仪中生物膜培养不过关。常规的利用活性污泥制备生物膜势必存在微生物活性较低和无法适应多种污水环境的缺点。而进口的该类型仪器一方面价格昂贵（约50万人民币左右；还须长期进口与仪器配套的生物膜）；另一方面由于我国和国外污水水质的差别，也使该仪器很难适应我国的水质条件。因此，拥有自主知识产权的BOD快速监测仪，并使其适应我国的实际使用环境，不仅具有极为广阔的市场前景，而且其技术也填补了我国环境监测的一项空白。其科研和经济价值都十分重大。

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