根据毕赤酵母高表达基因对特定密码子偏好的特性，选择毕赤酵母高表达基因偏好的密码子，替换人BMP-4成熟肽序列在毕赤酵母高表达基因中不常用的密码子，优化设计人BMP-4成熟肽表达序列并构建重组表达载体；转化毕赤酵母宿主菌和筛选高表达菌株；利用色谱纯化技术设计纯化路线，纯化重组人BMP-4；对纯化的重组蛋白进行生理活性检测。

目的：骨形态发生蛋白4（Bone morphogenetic protein 4，BMP4）是一种生长因子，具有明显促进细胞组织分化为骨组织的能力，在骨缺损、骨折的修复和脊柱融合等众多方面的骨科临床上有很高的应用价值。从哺乳动物骨骼材料中提取的天然BMP-4数量有限、成本高、且具有免疫源性，限制了其在临床上的应用。为此，我们建立了人BMP-4在毕赤酵母中的高效表达及纯化工艺。 方法：根据毕赤酵母高表达基因对特定密码子偏好的特性，选择毕赤酵母高表达基因偏好的密码子，替换人BMP-4成熟肽序列在毕赤酵母高表达基因中不常用的密码子，优化设计人BMP-4成熟肽表达序列并构建重组表达载体；转化毕赤酵母宿主菌和筛选高表达菌株；利用色谱纯化技术设计纯化路线，纯化重组人BMP-4；对纯化的重组蛋白进行生理活性检测。 结果：控制表达序列A+T含量在30-55%的范围内，尽可能使用毕赤酵母高表达基因偏好的密码子，优化设计人BMP-4表达序列，使人BMP-4的表达水平提高了4倍，在摇瓶表达中产量能达到48mg/L。发酵上清中的重组人BMP-4用SP Sepharose和heparin亲和色谱层析法进行纯化。对纯化后的人BMP-4进行生理活性的检测，结果显示重组人BMP-4能异位诱导软骨细胞的生成和增加效应细胞的碱性磷酸酶的活性，具有生理活性。 结论：通过对人BMP-4表达序列的优化设计，有效地解决了人BMP-4在毕赤酵母中表达量低的问题，同时建立了重组人BMP4纯化工艺，并证明毕赤酵母系统表达的人重组BMP-4具有明显的生理活性，为人BMP-4进一步的临床应用开发奠定了良好的基础。

第十二届“挑战杯”作品 三等奖
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